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免疫印跡與免疫檢測實(shí)驗

   

       免疫印跡(常稱(chēng)之為Western印跡),可用于檢測單克隆或多克隆抗體識別的抗原。

實(shí)驗材料
       蛋白質(zhì)
       試劑、試劑盒      

       轉緩沖液               

 

儀器、耗材

       搖床   海綿纖維素膜   尼龍膜   電轉儀
 
實(shí)驗步驟
      1.  制備抗原樣品,并用小型或標準尺寸的單向或雙向凝膠分離蛋白,在一個(gè)或多個(gè)泳道中分離預染色或生物素?;牡鞍踪|(zhì)分子量標準。
      2.  電泳完成后,拆卸凝膠夾層,去除積層膠。以適量的轉移緩沖液室溫平衡凝膠30 min。
      3.  將轉移盒放入一個(gè)較大的托盤(pán)中,加入足量的能蓋沒(méi)整個(gè)轉移盒的轉移緩沖液。
      4.  在塑料轉移盒的底邊,依次將下面物品組裝轉印夾層墊或海綿,一張剪切得如凝膠大小的濾紙,并預先以轉移緩沖液濕潤凝膠,用一試管或玻璃棒在凝膠表面緩慢滾動(dòng),以排去凝膠和濾紙間的氣泡。
 
圖一、利用轉印槽進(jìn)行免疫印跡


 
      5.  準備轉印膜,按凝膠大小但各邊都比凝膠大約1 mm 剪膜。成45。地慢慢將凝膠放入蒸餾水中,水將會(huì )滲進(jìn)膜中并潤濕整個(gè)表面。然后在轉移緩沖液中平衡10~15 min,PVDF膜短暫地在100%甲醇中放一下,然后在轉移緩沖液中平衡10~15 min。
      6.  用轉移緩沖液濕潤凝膠表面,直接將已潤濕的膜放在凝膠頂部,排去氣泡。
      7.  潤濕另一張Whatman 3MM 濾紙,并置于膜的陽(yáng)極面,排去所有氣泡,在濾紙的頂部放另一塊Scotch-Brite墊或海綿。
      8.  將轉移盒頂部的半面放置適當,扣緊,完成組裝。
      9.  往轉移槽中加入轉移緩沖液,按正確的極性方向將轉移盒放進(jìn)電轉儀中,連接電源。

      10.  在冷卻條件下100 V 電轉30~60 min,或在冷室中14 V 電轉過(guò)夜,
      11.  關(guān)電源,拆卸轉印裝置,取出轉印膜,并在膜上剪一小角或用軟性鉛筆或Paper-Mate筆作上標記定位。
      12.  凝膠用考馬斯亮藍染色以確定轉移效率。需要時(shí),也可將硝酸纖維素膜或PVDF膜以輔助方案提供的可逆染色方法使蛋白質(zhì)顯跡,也可用如考馬斯亮藍、印度墨墨汁、萘酚藍或膠體金不可逆染色。
      13.  進(jìn)行蛋白質(zhì)的免疫雜交和顯跡。

 

  (本文轉載丁香園)

 
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