免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實(shí)驗技術(shù)。高效價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標記抗體等),也可供特異性免疫治療用。
實(shí)驗方法原理
具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別,因此由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體,實(shí)際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外,抗體的產(chǎn)生具有回憶應答的規律性,現為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應答特點(diǎn)截然不同。這是由于記憶性B細胞參與再次應答所致。
實(shí)驗材料
家兔
試劑、試劑盒
滅菌生理鹽水 IgG 酒精 碘酒 羊毛脂 石蠟油 BCG FIA FCA-IgG
儀器、耗材:刀 鑷子 注射器 針頭 稱(chēng)量瓶 量筒 動(dòng)物固定架 三角燒瓶 手術(shù)器械 血管夾 黑絲線(xiàn) 放血管
實(shí)驗步驟
一、免疫方法
據抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說(shuō)明。
1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛,以酒精及碘酒消毒皮膚。
2. 第一次免疫 用2 ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱(chēng)FCA IgG液1 ml,每側腳掌皮下各注入0.5 ml。
3. 第二次免疫間隔10-14 天后,于兩側窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內注入FCA-IgG,每個(gè)淋巴結注0.1 ml,其余注入淋巴結附近皮下共1 ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時(shí),直接注入兩側窩及鼠蹊部皮下。4. 間隔7-10 天后,從耳靜脈采血0.5~1.0 ml,分離血清,以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(jià)(即試血)。效價(jià)至少應達到1∶16以上時(shí)才能放血。
5. 若效價(jià)未達到要求,可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內注射免疫。即于1 周內注射3 次,分別為0.1、0.3、0.5 ml。間隔1 周再試血。如效價(jià)達到要求應立即放血。另外,也可在第2 次免疫后,以弗氏不完全佐劑 (FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡(jiǎn)稱(chēng)FIA-IgG)再免疫1-2 次。注射部位、劑量和間隔均同第2 次,再試血測抗體效價(jià),如效價(jià)達到要求立即放血。
二、放血
1. 心臟采用血法
(1)家兔仰面,四肢縛于動(dòng)物固定架上(或由助手抓住四肢固定)。
(2)剪去左胸部兔毛,消毒皮膚。
(3)用左姆指摸到胸骨劍突處,食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟,并使心臟固定于左胸側位置。然后,以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)最強的部位。
(4)用50 ml注射器(連接16號針頭),傾針45°角度,對準心搏最強處刺入心臟抽血致死。
(5)將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中,待凝固后分離血清。
2. 頸動(dòng)脈放血法
(1)家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚。
(2)沿頸部中線(xiàn)切開(kāi)皮膚約10 cm,分離皮下組織,直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突肌。
(3)分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織,暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離。
(4)于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線(xiàn),分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線(xiàn)。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住。
(5)用尖頭小剪刀在兩根絲線(xiàn)間的動(dòng)脈璧上剪一小口,插入塑料放血管。再將近心端的絲線(xiàn)結扎固定于放血管上,以防放血管滑脫。
(6)松開(kāi)血管夾,使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100 ml。
三、分離血清
將三角燒瓶的血置37 ℃溫箱1 小時(shí),再置4 ℃冰箱內3~4 小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后,用毛細滴管吸取血清。于3000 rpm離心15 分鐘,取上清加入防腐劑(0.01 %硫柳汞或0.02 %疊氮鈉,最終濃度),分裝后置4 ℃冰箱中保存備用。 (本文轉載丁香園)