一、實(shí)驗原理

     植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環(huán)境條件（除個(gè)別種類(lèi)外），一般都能恢復生長(cháng)發(fā)育和繁殖。植物病原菌的分離就是指通過(guò)人工培養，從染病植物組織中將病原真菌與其它雜菌分開(kāi)來(lái)，并從寄主植物中分離出來(lái)，再將分離到的病原菌放在適宜環(huán)境內純化，這個(gè)過(guò)程總稱(chēng)為植物病菌的分離培養。植物病原真菌的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經(jīng)表面消毒和滅菌水清洗過(guò)后，移到人工培養基上培養。

二、實(shí)驗目的

     植物病原菌的分離培養是植物病理學(xué)實(shí)驗中最基本的操作技術(shù)之一，它對原害鑒定，病原形態(tài)觀(guān)察、植物病害接種體的培養等方面都是經(jīng)常使用的研究手段。通過(guò)本實(shí)驗，要求尋找出植物病原菌分離培養的一般原則和方法。

三、實(shí)驗材料及準備

     1．分離材料：梨黑斑?。ˋlternaria kikuchiana），柿樹(shù)圓斑?。≒estnlotia sp）及杉木炭疽?。℅lomerella cingolata）新發(fā)病的病葉；楊樹(shù)爛皮?。–ytospora chrysosperma）國槐腐爛?。―othiorella sp.）的帶有新病斑的枝條；油松種子。

     2．分離用具（每小組為單位）

     酒精燈4個(gè)，手術(shù)剪4把，眼科鑷4把，，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個(gè)（內放脫脂棉球）0.1%升汞瓶1個(gè)，5%乳酸瓶（60ml）1個(gè)，火柴1盒，濕、干紗布各4張，PDA培養基3瓶，培養皿（Φ9cm）24套，小燒杯（5ml）4個(gè)，大燒杯1個(gè)，斜面培養基12管。

四、實(shí)驗方法及步驟

    （一）分離前的準備工作

     1．工作環(huán)境的清潔和消毒

     分離培養一般在無(wú)菌室、無(wú)菌箱或無(wú)菌工作臺（超凈工作臺）上進(jìn)行，無(wú)菌室和無(wú)菌箱要經(jīng)過(guò)噴霧除塵，并用藥物或紫外線(xiàn)照射消毒（常用消毒藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線(xiàn)燈照射則需20-30分鐘）。在沒(méi)有上述設備條件時(shí)，在清潔房間里關(guān)閉門(mén)窗，避免空氣流動(dòng)，經(jīng)過(guò)噴霧除去空氣及地面灰塵后進(jìn)行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺上，避免工作時(shí)走動(dòng)，工作人員最好穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

     2．分離用具的消毒

     凡是和分離材料接觸的器皿（刀、剪、鑷、針等）都要隨時(shí)（至少在使用時(shí)）保持無(wú)菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時(shí)在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次（刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時(shí)過(guò)長(cháng)，以防退火）。再次使用時(shí)必須重復滅菌。培養皿、試驗等要經(jīng)過(guò)干熱滅菌。培養基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經(jīng)過(guò)高壓蒸氣滅菌。

     3．分離材料的選擇

     新發(fā)病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點(diǎn)病害應從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。