帶有水皰性口炎病毒（vesicularstomatitisvirusG，VSV-G）蛋白的假型逆轉錄病毒載體已被證明可將基因高效遞送到各種細胞中。其效率受相對細胞的生長(cháng)速度以及細胞膜上的磷脂酰絲氨酸的水平影響。

一、材料與試劑

     1.  DMEM（GIBCO，11995-065）

     2.  胎牛血清FBS（GEMBIO900-108）

     3.  青霉素/鏈霉素溶液（GIBCO15140-122）

     4.  NaCl（SIGMAS7653）

     5.  HEPES（SIGMAH7523）

     6.  Na2HPO4（SIGMAS7907）

     7.  CaCl2（SIGMAC5080）

     8.  氯喹，Chloroquine（SIGMAC6628）

     9.  Nabutyrate（SIGMAB5887）

     10.  Gag/pol（CellbiolabsRV-111）

     11.  VSVG和逆轉錄病毒載體（Clontech631512）

二、設備

     1.  24孔板

     2.  離心機

     3.  水浴

三、實(shí)驗步驟

     1.  第1天：將健康的293細胞置于10 cm 組織培養板中。（10 ml 培養基中每孔7×106細胞）

     2.  第2天：

    （1）準備Ca-P（calcium-phosphate）轉染液。

    （2）加入2×HeBS（pH7.0）450 μl 到Ca-P轉染液中并持續渦旋混勻。

    （3）用包含最終濃度25 μm 氯喹的新鮮的DMEM培養基更換細胞培養液。

    （4）逐步對細胞撒上900 μl 逆轉錄病毒載體混合物，并于37°C，孵育細胞。

    （5）3-4 h 后，用新鮮的DMEM培養基更換細胞培養液，添加終濃度為10 μm 的丁酸鈉，并于37°C，孵育細胞。注意：必須在12-14 h 后移除。

     3.  第3天：用新鮮的DMEM培養基更換含有丁酸鈉DMEM培養基，并于32℃，孵育細胞過(guò)夜。

     4.  第4天：收獲病毒上清并儲存于4℃。之后向細胞中加入新鮮的DMEM培養基并繼續于32℃，孵育細胞。

     5.  第5天：重復第4天。放置健康的293細胞供第二天tittering使用。

     6.  第6天：重復第4天。聚集所有上清并通過(guò)0.45微過(guò)濾器過(guò)濾。（如果需要高tittering病毒，于4°C，25 000 RPM離心3 h。小心移除上清，并用少于0.5 ml 的重懸病毒顆粒）。

     7.  加入5 μl 濃縮病毒至293細胞中（50%融合）供tittering檢測。用干冰凍結或乙醇濃縮病毒并儲存在-80℃。