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SPA的提取

     SPA提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等?,F將常用的方法介紹如下:


     1.煮沸提取法


     ⑴ 將菌株接種于蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基上,37℃培養20h~24h。


     ⑵ 0.15mol/L pH5.9PB液將菌苔洗下,配成10%V/V)的懸液。


     ⑶ 水浴中煮沸1h,迅速冷卻至4℃,4000r/min離心20min,去沉淀。


     ⑷ 1mol/LHCl將上清液調pH3.0~3.5,然后4000r/min離心30min。


     ⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min離心20min。


     ⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,4000r/min離心20min。


     ⑺ 沉淀(可直接凍干為粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解,12000r/min離心20min。


     ⑻ 上清液即為粗提SPA液。


     ⑼ Sephadex G100過(guò)柱,上樣后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脫,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。


     ⑽ OD275nm值及用對流免疫電泳檢測每管的活性,將有活性的各管合并、濃縮或凍干。


     2.溶菌酶消化法


     ⑴ 將培養的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液配成10%~15%的懸液。


     ⑵ 201W/W)的量加入SPA菌液與溶菌酶(活力為1萬(wàn)U/mg蛋白)37℃水溶攪拌24h。


     ⑶ 4℃冷卻后,以12000g離心30min。


     ⑷ 取上清,調pH值至7.0。


     ⑸ 加硫酸銨,邊加邊攪拌,使溶液呈80%的飽和度,4℃過(guò)夜。


     ⑹ 12000g離心30min。


     ⑺ 以少量蒸餾水將沉淀溶解。


     ⑻ 透析或過(guò)Sephadex G50除鹽,即為粗制的SPA制品。

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