(一)實(shí)驗目的:學(xué)習細菌的鞭毛染色法
(二)實(shí)驗原理:細菌的鞭毛極細,直徑一般為10-20nm,只有用電子顯微鏡才能觀(guān)察到。但是,如采用特殊的染色法,則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先用媒染劑處理,讓它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成?,F推薦以下兩種染色法。
(三)實(shí)驗器材
1. 活材料:培養12-16h的水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae),粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratia marcescens)或假單細胞菌(Pseudomonas sp.)斜面菌種。
2. 染色液和試劑:硝酸銀染色液(見(jiàn)附二、(一)、8)、Leifson染色液(見(jiàn)附二、(一-)、9)、香柏油、二甲苯。
3. 器材:載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環(huán),顯微鏡。
(四)實(shí)驗方法
1. 鍍銀法染色
(1)清洗玻片 選擇光滑無(wú)裂痕的玻片,最好選用新的。為了避免玻片相互重疊,應將玻片插在專(zhuān)用金屬架上,然后將玻片置洗衣粉過(guò)濾液中(洗衣粉煮沸后用濾紙過(guò)濾,以除去粗顆粒),煮沸20min.取出稍冷后用自來(lái)水沖洗、晾干,再放入濃洗液中浸泡5-6天,使用前取出玻片,用自來(lái)水沖去殘酸,再用蒸餾水洗。將水瀝干后,放入95%乙醇中脫水。
(2)菌液的制備及制片:菌齡較老的細菌容易失落鞭毛,所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上(培養基表面濕潤,斜面基部含有冷凝水)連續移接3-5代,以增強細菌的運動(dòng)力。最后一代菌種放恒溫箱中培養12-16h.然后,用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環(huán),移至盛有1-2mL無(wú)菌水的試管中,使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37℃恒溫箱中靜置10min(放置時(shí)間不宜太長(cháng),否則鞭毛會(huì )脫落),讓幼齡菌的鞭毛松展開(kāi)。然后,吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端,立即將玻片傾斜,使菌液緩慢地流向另一端,用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。
用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化后倒入無(wú)菌平皿中,待凝固后在平板中央點(diǎn)接活化了3-4代的細菌,恒溫培養12-16h后,取擴散菌落的邊緣制作涂片。
(3)染色
①滴加A液,染4-6min.
②用蒸餾水充分洗凈A液。
③用B液沖去殘水,再加B液于玻片上,在酒精燈火焰上加熱至冒氣,約維持0.5-1min(加熱時(shí)應隨時(shí)補充蒸發(fā)掉的染料,不可使玻片出現干涸區)。
④用蒸餾水洗,自然干燥。
(4)鏡檢:先低倍,再高倍,最后用油鏡檢查。
結果:菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色。
2. 改良Leifson染色法
(1)清洗玻片法同1.
(2)配制染料 見(jiàn)附錄二(一)9.染料配好后要過(guò)濾15-20次后染色效果才好。
(3)菌液的制備及涂片