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霉菌水浸標本片的制備與觀(guān)察

    (一)實(shí)驗目的:學(xué)習自制水浸片觀(guān)察霉菌的形態(tài)


    (二)實(shí)驗原理:霉菌的營(yíng)養體是分枝的絲狀體。其個(gè)體比細菌和放線(xiàn)菌大得多,分為基內菌絲和氣生菌絲。氣生菌絲中又可分化出繁殖絲。不同霉菌的繁殖菌絲可以形成不同的孢子。


     霉菌菌絲較粗大,細胞易收縮變形,且孢子容易飛散,所以制標本時(shí)常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成的霉菌標本片的特點(diǎn)是:細胞不變形,具有殺菌防腐作用,且不易干燥,能保持較長(cháng)時(shí)間,溶液本身呈藍色,有一定染色效果。


     利用培養在玻璃紙上的霉菌作為觀(guān)察材料,可以得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài);也可以直接挑取生長(cháng)在平板中的霉菌菌體制水浸片觀(guān)察。


    (三)實(shí)驗器材


     1. 活材料:在馬鈴薯瓊脂平板上或用玻璃紙透析培養法培養3-4天的根霉(Rhizpus sp.)、青霉(Penicillum sp.)、曲霉(Aspergillus sp.);


     2. 染色液和試劑:乳酸石炭酸棉藍染色液、50%酒精(V/V)。


     3. 器材:剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、解剖針、顯微鏡。


    (四)實(shí)驗方法


     1. 制水浸制片觀(guān)察法 


     在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液或蒸餾水,用解剖針從生長(cháng)有霉菌的平板中挑取少量帶有孢子的霉菌菌絲,用50%的乙醇浸潤,再用蒸餾水將浸過(guò)的菌絲洗一下,然后放入載玻片上的液滴中,仔細地用解剖針將菌絲分散開(kāi)來(lái)。蓋上蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡,且不要再移動(dòng)蓋玻片),先用低倍鏡,必要時(shí)轉換高倍鏡鏡檢并記錄觀(guān)察結果。


     2. 玻璃紙透析培養觀(guān)察法


    (1)玻璃紙的選擇與處理  要選擇能夠允許營(yíng)養物質(zhì)透過(guò)的玻璃紙。也可收集商品包裝用的玻璃紙,加水煮沸,然后用冷水沖洗。經(jīng)此處理后的玻璃紙若變硬,必定是不可用的,只有那些軟的可用。將那些可用的玻璃紙剪成適當大小,用水浸濕后,夾于舊報紙中,然后一起放入平皿內121℃滅菌30min備用。


    (2)菌種的培養  按無(wú)菌操作法,倒平板,冷凝后用滅菌的鑷子夾取無(wú)菌玻璃紙貼附于平板上,再用接種環(huán)沾取少許霉菌孢子,在玻璃紙上方輕輕抖落于紙上。然后將平板置28-30℃下培養3-5天,曲霉菌和青霉菌即可在玻璃紙上長(cháng)出單個(gè)菌落(根霉菌的氣生性強,形成的菌落鋪滿(mǎn)整個(gè)平板)。


    (3)制片與觀(guān)察  剪取玻璃紙透析法培養3-4天后長(cháng)有菌絲和孢子的玻璃紙一小塊,先放在50%乙醇中浸一下,洗掉脫落下來(lái)的孢子,并趕走菌體上的氣泡,然后正面向上貼附于干凈載玻片上,滴加1-2滴乳酸石炭酸棉藍液,小心地蓋上蓋玻片(注意不要產(chǎn)生氣泡),且不要移動(dòng)蓋玻片,以免搞亂菌絲。


     標本片制好后,先用低倍鏡觀(guān)察,必要時(shí)再換高倍鏡。注意觀(guān)察菌絲有無(wú)隔膜,有無(wú)假根、足細胞等特殊形態(tài)的菌絲。注意其無(wú)性繁殖器官的形狀和構造,孢子著(zhù)生的方式和孢子的形態(tài)、大小等。

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