PCR法是20世紀80年代中期建立起來(lái)的一種體外DNA擴增技術(shù)，其基本原理是酶促DNA合成反應，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA聚合酶的作用，使DNA 鏈擴增延伸。該方法具有靈敏度高、特異性強、快速的特點(diǎn)，但其對實(shí)驗環(huán)境的要求嚴格，實(shí)驗成本較高，有時(shí)還有假陽(yáng)性的現象出現。

1、儀器設備

   超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統、臺式離心機、旋渦混懸器等。

2、實(shí)驗試劑

   選用美國Stratagene公司生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒（內有引物、陽(yáng)性對照、內對照、StrataClean resin、緩沖液），dNTP，TapDNA聚合酶，緩沖液，瓊脂糖，礦物油。

3、實(shí)驗操作

   PCR反應的前期操作應在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。

  （1）樣品的收集：待測細胞用無(wú)雙抗培養基培養7d，用無(wú)菌容器取上清液500ul，4℃保存待測。

  （2）模板的制作：在無(wú)菌的條件下，取細胞培養上清100ul于一無(wú)菌的0.5ml塑料離心管內，蓋好蓋子，95℃水浴加熱5min。

  （3）打開(kāi)蓋子，向管內加StrataClean resin10ul，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5—10s，吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢，4℃保存。

  （4）PCR反應：反應體系最適條件為：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶?？偡磻w系為50ul，反應用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應如下表：

表 反應程序

   ①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應緩沖液。

   ②依次加入下列成分：0.4uldNTPs（25mmol/l），0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul），2ul引物。

   ③加2ul去離子水，總體積45ul。

   ④加2ul已制成的模板到反應體系中。

   ⑤陽(yáng)性對照，內對照各5ul加入到各自的反應體系中。

   ⑥取一支含有以上反應體系的離心管，加入5ul去離子水作為陰性對照管。

   ⑦在反應體系中加入100ul礦物油。

  （5）瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應結束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結束后，凝膠成像分析結果。

  （6）結果分析：該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上，MARKER、陽(yáng)性對照、內對照均會(huì )出現不同的電泳條帶，當被檢樣品泳道出現明亮條帶，且位置在陽(yáng)性對照和陰性對照條帶位置之間，即可認為該樣品被支原體污染。有時(shí)還會(huì )發(fā)現一條泳道出現多條，可能是該樣品感染兩種以上支原體所致。如果泳道內條帶隱約出現，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。