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PCR法檢測支原體

   PCR法是20世紀80年代中期建立起來(lái)的一種體外DNA擴增技術(shù),其基本原理是酶促DNA合成反應,即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下,經(jīng)DNA聚合酶的作用,使DNA 鏈擴增延伸。該方法具有靈敏度高、特異性強、快速的特點(diǎn),但其對實(shí)驗環(huán)境的要求嚴格,實(shí)驗成本較高,有時(shí)還有假陽(yáng)性的現象出現。

 

1、儀器設備

 

   超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統、臺式離心機、旋渦混懸器等。

 

2、實(shí)驗試劑

 

   選用美國Stratagene公司生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒(內有引物、陽(yáng)性對照、內對照、StrataClean resin、緩沖液),dNTP,TapDNA聚合酶,緩沖液,瓊脂糖,礦物油。

 

3、實(shí)驗操作

 

   PCR反應的前期操作應在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。

 

  (1)樣品的收集:待測細胞用無(wú)雙抗培養基培養7d,用無(wú)菌容器取上清液500ul,4℃保存待測。

 

  (2)模板的制作:在無(wú)菌的條件下,取細胞培養上清100ul于一無(wú)菌的0.5ml塑料離心管內,蓋好蓋子,95℃水浴加熱5min。

 

  (3)打開(kāi)蓋子,向管內加StrataClean resin10ul,蓋好蓋子,旋渦混懸器混合,離心5—10s,吸取上清至一新的塑料離心管中,模板制作完畢,4℃保存。

 

  (4)PCR反應:反應體系最適條件為:10mmol/lTris-HCL(pH8.38);50mmol/lHCL;1.5-2.5mmol/lMgCL2;200umol/ldNTP;2UDapDNA聚合酶??偡磻w系為50ul,反應用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應如下表:

 

表 反應程序

 

   ①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應緩沖液。


   ②依次加入下列成分:0.4uldNTPs(25mmol/l),0.4ulTaqDNA聚合酶(5U/ul),2ul引物。


   ③加2ul去離子水,總體積45ul。

 

   ④加2ul已制成的模板到反應體系中。

 

   ⑤陽(yáng)性對照,內對照各5ul加入到各自的反應體系中。

 

   ⑥取一支含有以上反應體系的離心管,加入5ul去離子水作為陰性對照管。

 

   ⑦在反應體系中加入100ul礦物油。

 

  (5)瓊脂糖凝膠電泳:PCR反應結束后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結束后,凝膠成像分析結果。

 

  (6)結果分析:該方法為檢測支原體的定性方法,在電泳泳道上,MARKER、陽(yáng)性對照、內對照均會(huì )出現不同的電泳條帶,當被檢樣品泳道出現明亮條帶,且位置在陽(yáng)性對照和陰性對照條帶位置之間,即可認為該樣品被支原體污染。有時(shí)還會(huì )發(fā)現一條泳道出現多條,可能是該樣品感染兩種以上支原體所致。如果泳道內條帶隱約出現,則可懷疑有支原體污染,重做該樣品。

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