一、實(shí)驗材料 

     ① 肽庫：美國NewEnglandBiolabs的環(huán)狀7肽庫(Ph，D-C7CTm Phage Display Peptide LibraryKit)。 

     ② 人正常細胞株和人腫瘤細胞株。 

     ③ 裸鼠。 

     二、實(shí)驗器材和常用試劑 

     同蛋白質(zhì)分子為篩選靶目標的實(shí)驗方法。 

     三、實(shí)驗方法 

     1.目標噬菌體的初篩 

     ① 荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的準備：選用4～6周齡雌性健康BALB/c裸鼠數只，于SPF級動(dòng)物實(shí)驗室常規無(wú)菌培養，待用。選取生長(cháng)狀態(tài)良好的肝癌細胞，胰蛋白酶常規消化后用含有20%新生牛血清的RPMll640完全培養基重懸，細胞計數后，調節細胞濃度達到107 個(gè)細胞/ml。將重懸好的細胞，用1ml的無(wú)菌一次性注射器在裸鼠右側腋下，采用皮下注射的方法將200ul(約5×106 個(gè))的腫瘤細胞注射到裸鼠體內。約3～4周后腫瘤達到可供使用的大小。

     ② 荷瘤裸鼠經(jīng)乙醚麻醉后，將1011噬菌體肽文庫靜脈注射人荷瘤裸鼠體內(這些噬菌體經(jīng)過(guò)血液循環(huán)后，含肝癌細胞特異性肽的噬菌體將會(huì )吸附于肝癌細胞上或被癌細胞內吞)，5min后用10ml的DMEM、100ml生理鹽水對小鼠進(jìn)行心臟灌流。取出裸鼠一部分腫瘤組織用PBS洗3次，研磨后，加入20 ml預先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞，37℃、230r/rain振蕩培養4.5h，分別檢測從腫瘤回收的噬菌體及其擴增后的效價(jià)。

     ③ 荷瘤裸鼠繼續用多聚甲醛固定液灌流至肝臟變白，取下荷瘤裸鼠的主要器官和一部分腫瘤組織，浸入3%多聚甲醛固定，以備組織切片用。 

     ④ 從裸鼠的腫瘤組織回收噬菌體含有能特異性吸附于腫瘤組織的多肽，對回收得到的噬菌體庫用上述相同的方法再進(jìn)行1次體內循環(huán)篩選，即得到了初篩的目標噬菌體。 

     2. 噬菌體單克隆的擴增及純化：同以細胞為靶目標的篩選。 

     3. 目標噬菌體克隆的鑒定 

     ① 噬菌體在體內組織分布的免疫組織化學(xué)鑒定：取出浸在3%多聚甲醛中的組織樣品，自然干燥后，切片后貼到玻片上，晾干，丙酮固定5rain，PBST洗3次，每次3min。1%過(guò)氧化氫甲醇混合液室溫浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。5%脫脂奶粉室溫封阻20rain，加入按1：1 000稀釋的噬菌體M13抗血清，37℃濕盒中溫育1h，PBST洗3次，每次5rain。加入1：300稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37℃濕盒中溫育1 h，PBST洗3次，每次5rain。DAB進(jìn)行顯色反應(約12 rain)，用流水終止反應；蘇木青復染細胞核約3rain，自來(lái)水沖洗；加飽和碳酸鋰分色，用乙醇逐級脫水，二甲苯3rain透明，最后用中性樹(shù)脂封片觀(guān)察。

     ② 體外培養細胞水平的鑒定：同以細胞為靶目標的篩選。 

     取9支試管編號后，按下表順序加入試劑：   

     加畢，溫和混勻，20～37℃下靜置10分鐘，與550nm下比色測定，以總膽固醇量（mg%）為橫坐標，OD值為縱坐標做出標準曲線(xiàn)。 

     二、樣品測定 

     取3支試管編號后，分別加入試劑，與標準曲線(xiàn)同時(shí)作比色測定： 

     加畢，溫和混勻，20～37℃下靜置10分鐘，與550nm下比色測定，測得OD值從標準曲線(xiàn)中可查出樣品的膽固醇含量。

 
     注意事項：

 
    （1）混合酸粘度大，要用封口膜充分混勻。保溫后如有分層，再次混勻。 

    （2）混合酸配制時(shí)，將濃硫酸加入冰乙酸中，次序不可顛倒。