細胞遺傳學(xué)意在確定一個(gè)基因組中與眾不同的結構特征。這說(shuō)起來(lái)容易，做起來(lái)難。多年來(lái)，研究人員手頭的工具很有限，只有吉姆薩染色、FISH和DNA芯片。新興的DNA測序技術(shù)將細胞遺傳學(xué)的分辨率提高到前所未有的水平，縮小了分子細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)之間的距離。

     然而，測序，想說(shuō)愛(ài)你不容易。測序讀長(cháng)仍然太短，難以直接回答細胞遺傳學(xué)的問(wèn)題。當然，新的策略在不斷開(kāi)發(fā)中。在此，我們展望一下基因組測序在發(fā)現染色體結構變異（CV）上的前景，盡管有些區域目前仍無(wú)法解析，但隨著(zhù)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，終究會(huì )突破。

     分子細胞遺傳學(xué)的技術(shù)

     吉姆薩染色、核型分析等技術(shù)適合觀(guān)察Mb規模的染色體畸變，如非整倍體和大的重排，這可在顯微鏡下觀(guān)察到。利用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)，研究人員可檢測到低至500 kb的結構差異。

     DNA芯片的引入實(shí)現了拷貝數變異和染色體結構變化的檢測，其分辨率低至5-10 kb。不過(guò)它們并不能提供重復拷貝的位置信息。它們也不能檢測平衡易位?；蛟S更重要的是，芯片在高度重復的序列上表現不太好，因而無(wú)法分辨異常序列的斷裂點(diǎn)。

     我們還有另一個(gè)選擇，新一代測序（NGS）。據Illumina公司生殖與優(yōu)生健康的市場(chǎng)部經(jīng)理Rich Shippy介紹，NGS可檢測所有的畸變類(lèi)型，包括平衡易位、倒位和序列水平的變異。他認為，與芯片相比，NGS能更加精確地定位CNV，達到近乎單核苷酸的分辨率。

     NGS分析的策略

     在開(kāi)展分子細胞遺傳學(xué)分析時(shí)，測序的能力無(wú)疑取決于多個(gè)參數，包括文庫大小、讀長(cháng)、測序深度以及待分析序列的獨特性。當然，它還取決于分析類(lèi)型。

     華盛頓大學(xué)的Evan Eichler教授指出，當測序深度達到25倍時(shí)，就能可靠地檢測低至2-3 kb的缺失和重復，比其他方法至少高了一個(gè)數量級。深度讀取能夠確定絕對拷貝數，但它不能判斷插入序列或倒位，也不能區分重復序列是串聯(lián)還是分散在基因組中。

     為了確定重復的位置，研究人員主要依賴(lài)于雙端測序的方法，它從DNA序列兩端開(kāi)始測序，其正向和反向read之間的固定距離就代表插入片段的大小。Eichler解釋道：“你要找的是固定在某一位置的一組read，以及固定在另一位置的一組相反的read。就易位而言，一組可能定位到10號染色體，而另一組定位到20號染色體。那么我抓到了斷裂點(diǎn)?！睂τ诘刮?，配對的read可能位于相反的方向。

     研究人員也采取split-read的策略，以尋找那些一個(gè)read能定位到參考基因組，而另一個(gè)read不能定位（因為它位于重排斷裂點(diǎn)的另一側）的序列。隨后算法會(huì )搜索參考基因組，尋找那些未定位read的定位點(diǎn)。這種分析有望檢測更小的插入和缺失。

     另一種方法就是序列組裝，其中read被放在一起，通過(guò)合并重疊序列而形成連續的contig。這通常依賴(lài)于de novo和本地組裝算法的組合，因其序列長(cháng)且足夠準確，被認為是最有希望確定任何染色體畸變斷裂點(diǎn)的方法。

     讀長(cháng)越長(cháng)，希望越大

     Evan Eichler教授指出：“如果與細胞遺傳學(xué)易位、缺失、重復或倒位相關(guān)的所有斷裂點(diǎn)都定位在單一序列內，那就不會(huì )有什么問(wèn)題。但許多易位都定位到大的、高度相同的重復序列中，這也是系統無(wú)能為力的地方。我們沒(méi)有足夠大的庫，或者說(shuō)單個(gè)read不夠長(cháng)?！?/span>

     所謂的第三代測序能提供明顯更長(cháng)的read，有望解決這一問(wèn)題。例如，Pacific Biosciences的最新試劑帶來(lái)了8,500 bp的讀長(cháng)，甚至有相當一部分read超過(guò)30,000 bp。這些read可跨越許多重復區域，將它們定位到參考基因組中。

     Illumina的Moleculo技術(shù)也提供了一種單體型策略，但不是基于長(cháng)的read，而是統計學(xué)和條形碼。該公司最近在《Nature Biotechnology》上介紹了這種方法，名為“統計學(xué)輔助的長(cháng)read單體型分析（SLRH）”。利用SLRH，他們能夠將三個(gè)人類(lèi)基因組中99%的單核苷酸劃分到長(cháng)度為0.2-1 Mb的單體型塊中1。

     當然，更長(cháng)read的最終目標是從頭開(kāi)始構建出一個(gè)基因組。畢竟，這才是分子細胞遺傳學(xué)家所追求的，基因組結構的準確描述。Eichler認為：“這是此領(lǐng)域的圣杯：如果你拿到一個(gè)基因組，測序，并無(wú)需任何指導將其準確組裝，那么你就大功告成了。所有的分子細胞遺傳學(xué)家將失去工作。你會(huì )了解所有的倒位、缺失和重復?！?/span>

     這一天可能不會(huì )太遙遠。在上個(gè)月召開(kāi)的基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展大會(huì )（AGBT）上，Pacific Biosciences宣布了首個(gè)只利用PacBio read的de novo人類(lèi)基因組組裝。利用平均讀長(cháng)為7,700 bp的reads，他們組裝了54x的基因組，據介紹，讀長(cháng)將在一年之內達到20,000 bp。當這一切實(shí)現時(shí)，細胞遺傳學(xué)的答案可能唾手可得。