1. 材料和試劑

     1.1培養液A ：DMEM 培養液添加10%的胎牛血清(FBS)。

     1.2培養液B：DMEM培養液添加10%的胎牛血清(FBS)和終濃度為0.7--1μg/ml的放線(xiàn)菌素D。

     1.3 L929細胞株：鼠結締組織纖維母細胞，來(lái)源于22天雄性C3H鼠皮下組織。

     1.4 結晶紫染色溶液：0。05%結晶紫 (50mg結晶紫加入20ml乙醇,加蒸餾水定容至100ml)，蒸餾水稀釋。

     1.5 脫色液：(1)乙二醇獨甲醚50%，蒸餾水稀釋。

     (2)乙醇50%，乙酸0.01%(V/V)，蒸餾水稀釋。

     1.6 胰酶：消化貼壁L929細胞。

     1.7 半效稀釋度TNF標準品：1000IU/ml。

2. 實(shí)驗用具

     超凈工作臺，細胞培養 烘箱，酒精燈，顯微鏡，細胞計數器，微量移液器，細胞培養板，細胞稀釋槽，酶標儀。

3. 操作步驟

     3.1樣板：棄L929細胞培養瓶中的培養液，加入800—900μl胰酶消化細胞，細胞收縮后，棄胰酶，加入4ml培養液A，吹打細胞，混勻，用細胞計數板在顯微鏡下計數，并計算所需細胞總數，培養液體積，將消化好未貼壁的細胞重新懸浮于完全培養液A，并調整細胞濃度為10×104/ml左右并將細胞接種于96孔培養板中，每孔100μl,37°C，5%CO2培養過(guò)夜或24小時(shí)，待細胞貼滿(mǎn)板壁80%以上時(shí)，方可加樣。

     3.2 樣品處理和稀釋?zhuān)簩⒋郎y樣品和標準品用培養液B溶解至1 ml，(樣品為凍干粉狀)。如標準品為1000IU/ml，10倍稀釋至100IU/ml作為起始濃度，樣品則根據實(shí)際情況都做10倍梯度稀釋?zhuān)⒁宰畹蜐舛榷槠鹗紳舛?以上操作均在24孔板中操作)。

     從樣品和標準品中的起始濃度中取200μl加入到96孔板A2-A12中，其余各孔均加入150μl培養液B，再從A2-A12中各取50μl，對B-H各排進(jìn)行逐級四倍梯度稀釋.

      3.3 加樣：標準品和樣品經(jīng)稀釋后，吸去已經(jīng)培養好的細胞培養板中的上清液，每孔依次加樣100μl，并在邊緣未加樣的各孔加入100μl培養液B，消除邊緣效應，放入烘箱37°C，5%CO2，培養過(guò)夜。

     3.4 染色和脫色：L929細胞培養過(guò)夜后，鏡檢在半數死亡孔到達D或E時(shí)終止反應，吸取上清，輕輕吹打2—3次，除去死細胞，每孔加入染色液30μl，靜置5分鐘左右。

     用流水輕輕沖掉染色液，每孔加入100μl脫色液脫色，輕輕搖動(dòng)使脫色完全，然后于酶標儀 570nm波長(cháng)下比色，測O.D.值,并設對照.

     4. 處理數據:在座標紙上以570nm O.D.值(雙孔加樣測兩點(diǎn)值的平均)對稀釋倍數做圖,并以標準品的最低,最高O.D.之平均值做一平行于X軸的直線(xiàn)交各曲線(xiàn),以各相應曲線(xiàn)與該直線(xiàn)交點(diǎn)在X軸上讀出半效量的稀釋度,按下式計算效價(jià):

     TNF成品活性(IU/ml)=標準品效價(jià)*(樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數)*(標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效量的稀釋度)