基本方案: 灌注消化法
實(shí)驗材料:
1. 哺乳動(dòng)物胸導管淋巴管
2. 1×PBS,含青霉素100u/ml和鏈霉素100μg/ml,pH7.4
3. 0.2%Ⅰ型膠原酶
4. 慕絲線(xiàn)(7號線(xiàn))、細鐵絲
5. 眼科剪,眼科鑷
6. 離心管(15ml、50ml)
實(shí)驗方法:
1. 處死動(dòng)物后,打開(kāi)胸腔,分離胸導管,在胸導管上端結扎,切取10-15cm的一段。將胸導管放入預冷PBS中漂洗。
2. 在解剖顯微鏡下,用眼科剪和眼科鑷剝除外膜的脂肪和纖維組織,然后用PBS反復沖洗管腔。
3. 將胸導管移入含PBS的大培養皿中,清洗3次。在胸導管的遠端插入靜脈留置針,并結扎固定。用PBS沖洗管腔后,將游離端結扎。用靜脈留置針向管腔內注入消化液,至淋巴管充盈為止。在37℃條件下,消化10min。淋巴管的管壁較薄,灌注消化時(shí)間不宜過(guò)長(cháng),以免消化過(guò)度,引起成纖維細胞的污染。
4. 取出胸導管,在游離端剪一小口,用離心管收集消化液,然后用培養液沖洗管腔,收集消化液和沖洗液,以1000r/min,離心10min。離心后吸去上清液,用培養液輕輕混懸細胞。
5. 將細胞接種于培養皿或培養板中,培養24h后補充培養液,繼續培養。每隔2-3d換液1次。換液時(shí),吸去1/2-2/3培養液,再加入新鮮培養液。
6. 原代培養4-6h后,大部分細胞已貼壁生長(cháng)。24h后,內皮細胞形成由數個(gè)細胞組成的細胞群。淋巴管內皮細胞的活性較低,原代培養時(shí)細胞生長(cháng)緩慢。2-3周后,細胞生長(cháng)形成單層。淋巴管內皮單層呈卵石狀特征性排列,可傳代培養。
7. PriCells-原代內皮細胞特制基礎培養基
8. PriCells-原代內皮細胞培養特制添加劑
9. PriCells-原代細胞分離試劑盒
10. PriCells-原代細胞 鑒定 試劑盒