背景知識：

    細胞轉染技術(shù)是指將外源分子如DNA、RNA等導入整合細胞的技術(shù)。隨著(zhù)分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究極影功能、調控極影表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應用越來(lái)越廣泛。影響轉染效率的因素有細胞株本身的特性和活性、細胞培養條件、轉染的DNA或RNA的質(zhì)量、轉染方法、轉染試劑的選擇等。常規轉染技術(shù)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬間轉染，二是穩定轉染。瞬時(shí)轉染是外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細胞中科存在多個(gè)拷貝數，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動(dòng)子和其他調控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉染效率較高，在轉染后24h~72h內分析果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白、β-半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測。穩定轉染是指外源DNA既可以整合到宿主細胞染色體上，也可能作為一種游離體存在。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約萬(wàn)分之一轉染細胞能整合，通常需要一些選擇性標記，如APH、HPH、TK等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。

    本實(shí)驗采用帶有綠色熒光蛋白極影的質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體轉染人的腫瘤細胞系。綠色熒光蛋白（GFP）來(lái)源于海洋生物水木，近年來(lái)在生物化學(xué)和細胞生物學(xué)中成為最廣泛應用的標記性蛋白質(zhì)之一。隨著(zhù)對極影表達的調控，蛋白質(zhì)在活細胞中自然狀態(tài)下的變化等重要問(wèn)題研究的深入，迫切需要一種操作方便、不用加外源底物就能在活細胞中檢測的分子探針。GFP就能滿(mǎn)足這些要求，，在分子生物學(xué)中有廣泛的應用前景。GFP cDNA從水母中分離得到，是在研究水木的發(fā)光機制是發(fā)現的。鈣離子和腔腸素于水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白發(fā)藍色熒光，同時(shí)激發(fā)GFP，使其發(fā)綠色熒光。GFP基因汗3個(gè)外顯子，長(cháng)2.6kb。GEP是由238個(gè)氨基酸所組成的單體蛋白，其性質(zhì)十分穩定。GFP在不加任何外源物質(zhì)的情況下，經(jīng)紫外光或藍光激發(fā)后即可產(chǎn)生綠色熒光，且熒光性質(zhì)穩定。GFP基因與目的基因相連接，不影響目的基因的表達且能較好的標識出目的基因產(chǎn)物的位置。目前，GFP的應用已非常廣泛。

    2.對GFP質(zhì)粒進(jìn)行除菌處理和濃度測定，可采用無(wú)水乙醇沉淀GFP質(zhì)粒，再用70%的乙醇洗1或2次，將沉淀的質(zhì)粒溶于滅菌的TE中，然后用紫外粉光關(guān)都系測出質(zhì)粒的準確濃度，質(zhì)粒的濃度（μg/ml）=OD260值×50μg/ml×稀釋倍數。

    3.當細胞融合約為80%時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行轉染處理。在一個(gè)1.5ml的EP管中，加入100μl無(wú)血清DMEM培養基，取2ugGFP質(zhì)粒DNA溶解其中；在另一個(gè)1.5mlEP管中，加入100ul無(wú)血清DMEM培養基，取6-8ul脂質(zhì)體轉染劑稀釋于其中，再將兩管溶液混合均勻，室溫下放置20min。

     4.用2ml無(wú)血清DMEM培養基漂洗細胞2遍，向質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體轉染劑的混合液加入0.8ml無(wú)血清DMEM培養基并混勻，然后加到漂洗過(guò)的細胞上。

     5.將細胞放入培養箱培養3-8h，然后加入1ml含20%FBS的DMEM培養基繼續培養。

     6.培養24h后，將培養基吸出，加入2ml含10%FBS的DMEM培養基，37℃，5%CO2培養箱培養。

     7.在熒光顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)察細胞，表達GFP的細胞在藍光激發(fā)下可呈現綠色熒光。

注意事項：

    1.注意細胞的生長(cháng)狀態(tài)，最適合轉染的細胞是達到指數生長(cháng)期生長(cháng)旺盛的細胞。

    2.實(shí)驗前進(jìn)行預試驗確定適當的接種量和培養時(shí)間。

    3.DNA若不純，會(huì )嚴重影響轉染效率。