1 預先培養材料細胞，并處理準備實(shí)驗用在載玻片，蓋玻片。

    2 是眼前配置0.2%的常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，將溶液放入60攝氏度水浴中，每個(gè)載玻片放入溶液中3S，然后取出。將此載玻片水平放進(jìn)37攝氏度溫箱中，大于4h，即可使用。

    3 取處于對數期，生長(cháng)良好的MCF-7細胞，至于不同劑量的UV下照射一段時(shí)間，若想觀(guān)察細胞的DNA損傷修復情況，還可將部分細胞在培養箱中培養一段時(shí)間?？稍O置不同時(shí)間梯度來(lái)做對照實(shí)驗。

    4 細胞消化后，離心富集，并用PBS液洗滌2-3次，清洗過(guò)程中要注意細胞要置于冰盒中，以抑制DNA損傷修復系統的持續作用，吹打細胞懸液不要過(guò)于激烈，以免細胞進(jìn)一步受到機械損傷。最后用PBS液將其密度調整為1*106-2*106個(gè)細胞/m.l

    5 制片：在載玻片兩端用搭橋法放置蓋片，兩搭橋蓋片間寬度為1cm，將細胞懸液與配置好的1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMP）以1:1的比例在小離心管內混勻；在橋面蓋片和載玻片間灌入約100ul細胞與膠的混合液，置于4℃。

   6 膠凝固20min后，小心從載玻片一側抽取下各張搭橋蓋片，抽取過(guò)程中注意保持膠面平整。

    7 裂解：將載玻片移入裂解槽，注入裂解液，浸沒(méi)玻片，4℃避光裂解1.5-2h。

    8 水洗：將載玻片移入新的裂解槽，注入三蒸水浸沒(méi)玻片，4攝氏度水洗3次，每次5min。

    9 解旋：將載玻片移入新的裂解槽，注入電泳緩沖液，浸沒(méi)玻片，4攝氏度解旋20min。

    10電泳：將載片移入電泳槽，調節電泳槽兩端電壓為20V，200mA，4攝氏度，電泳20min。

    11中和：將載玻片移入新的裂解槽，注入中和液，浸沒(méi)玻片，4攝氏度中和三次，每次5min.

    12 梯度脫水：將載玻片移入新的裂解槽，進(jìn)行梯度乙醇脫水（80%、100%），每個(gè)梯度脫水5min。

    13 待載玻片室溫干燥后，每片滴加PI（20ug/ml）20ul，再覆蓋蓋玻片，避光染色20min，注意蓋片下不要產(chǎn)生氣泡。

    14 熒光顯微鏡下觀(guān)察、采圖，每份樣品隨機拍攝50個(gè)DNA受損細胞圖像，還可用CASP彗星專(zhuān)用數據分析軟件進(jìn)行數據分析

注意事項:

    1 裂解液應現配現用，部分試劑需使用前加入。

    2 鋪第一層常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，應將玻片水平放置，以保持膠面平整。

    3 染色時(shí)注意玻片平置，以使染液均勻分布在標本上，使之著(zhù)色均一。

    4 實(shí)驗中所用的水要用蒸餾水，載玻片應清潔無(wú)塵，否則不能得到干凈的背景。

    5 抽取搭橋用的蓋片時(shí)，一定要待完全膠凝固后，水平抽動(dòng)，動(dòng)作小心，防止因用力過(guò)猛或將膠破壞。

    6 蓋玻片、載玻片均需提前準備浸酸、清洗，這是保證片子質(zhì)量的重要環(huán)節。