1 預先培養材料細胞,并處理準備實(shí)驗用在載玻片,蓋玻片。
2 是眼前配置0.2%的常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠,將溶液放入60攝氏度水浴中,每個(gè)載玻片放入溶液中3S,然后取出。將此載玻片水平放進(jìn)37攝氏度溫箱中,大于4h,即可使用。
3 取處于對數期,生長(cháng)良好的MCF-7細胞,至于不同劑量的UV下照射一段時(shí)間,若想觀(guān)察細胞的DNA損傷修復情況,還可將部分細胞在培養箱中培養一段時(shí)間??稍O置不同時(shí)間梯度來(lái)做對照實(shí)驗。
4 細胞消化后,離心富集,并用PBS液洗滌2-3次,清洗過(guò)程中要注意細胞要置于冰盒中,以抑制DNA損傷修復系統的持續作用,吹打細胞懸液不要過(guò)于激烈,以免細胞進(jìn)一步受到機械損傷。最后用PBS液將其密度調整為1*106-2*106個(gè)細胞/m.l
5 制片:在載玻片兩端用搭橋法放置蓋片,兩搭橋蓋片間寬度為1cm,將細胞懸液與配置好的1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMP)以1:1的比例在小離心管內混勻;在橋面蓋片和載玻片間灌入約100ul細胞與膠的混合液,置于4℃。
6 膠凝固20min后,小心從載玻片一側抽取下各張搭橋蓋片,抽取過(guò)程中注意保持膠面平整。
7 裂解:將載玻片移入裂解槽,注入裂解液,浸沒(méi)玻片,4℃避光裂解1.5-2h。
8 水洗:將載玻片移入新的裂解槽,注入三蒸水浸沒(méi)玻片,4攝氏度水洗3次,每次5min。
9 解旋:將載玻片移入新的裂解槽,注入電泳緩沖液,浸沒(méi)玻片,4攝氏度解旋20min。
10電泳:將載片移入電泳槽,調節電泳槽兩端電壓為20V,200mA,4攝氏度,電泳20min。
11中和:將載玻片移入新的裂解槽,注入中和液,浸沒(méi)玻片,4攝氏度中和三次,每次5min.
12 梯度脫水:將載玻片移入新的裂解槽,進(jìn)行梯度乙醇脫水(80%、100%),每個(gè)梯度脫水5min。
13 待載玻片室溫干燥后,每片滴加PI(20ug/ml)20ul,再覆蓋蓋玻片,避光染色20min,注意蓋片下不要產(chǎn)生氣泡。
14 熒光顯微鏡下觀(guān)察、采圖,每份樣品隨機拍攝50個(gè)DNA受損細胞圖像,還可用CASP彗星專(zhuān)用數據分析軟件進(jìn)行數據分析
注意事項:
1 裂解液應現配現用,部分試劑需使用前加入。
2 鋪第一層常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后,應將玻片水平放置,以保持膠面平整。
3 染色時(shí)注意玻片平置,以使染液均勻分布在標本上,使之著(zhù)色均一。
4 實(shí)驗中所用的水要用蒸餾水,載玻片應清潔無(wú)塵,否則不能得到干凈的背景。
5 抽取搭橋用的蓋片時(shí),一定要待完全膠凝固后,水平抽動(dòng),動(dòng)作小心,防止因用力過(guò)猛或將膠破壞。
6 蓋玻片、載玻片均需提前準備浸酸、清洗,這是保證片子質(zhì)量的重要環(huán)節。