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流式細胞術(shù)檢測技術(shù)

流式細胞術(shù)檢測細胞周期 


    1.實(shí)驗原理  用流式細胞儀檢測細胞周期,通常用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染細胞核。PI在一定波長(cháng)的光下發(fā)出熒光,其強度與DNA含量成正比。通過(guò)流式細胞儀分析各時(shí)期的細胞百分數,可檢測細胞的增殖、凋亡。 


    2.流式細胞儀檢測A549細胞周期步驟  收集對數生長(cháng)期細胞,計數,以(1~5)×105/孔接種于6孔板,置37℃,5%CO2條件下培養過(guò)夜,使細胞貼壁。次日更換培養液,各孔分別加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同濃度茶氨酸的細胞培養液2 mL/孔,繼續常規培養;每24 h同法換液一次。每個(gè)濃度設3個(gè)重復。  48 h后,中止培養,胰酶消化后,收集細胞于流式管1000 r/min離心5min,棄上,冷PBS洗滌細胞3次,離心去上清;  一邊震蕩一邊向細胞沉淀中加入70%預冷乙醇混勻,4℃固定18 h以上;離心,棄去乙醇上清,加入預冷的PBS洗沉淀1次,離心去上清;  加入RNA酶(50 mg/L)10 μL/孔和PI(50 mg/L)300 μL/孔,震蕩混勻。室溫、避光反應30 min;  流式細胞儀進(jìn)行DNA檢測,用Modifit軟件分析各時(shí)相細胞周期的比例。

流式細胞儀檢測A549細胞凋亡


    實(shí)驗原理


    在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側。AnnexinV是一種分子量為35~36 kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。  碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,它不能透過(guò)完整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細胞區分開(kāi)來(lái)。


流式細胞儀檢測A549細胞凋亡


    流式實(shí)驗步驟  


    收集對數生長(cháng)期A(yíng)549細胞,計數,以(1~5)×105個(gè)/孔接種于6孔板,置37℃,5%CO2條件下培養過(guò)夜,使細胞貼壁;次日更換培養液,各孔分別加入含有不同濃度茶氨酸的細胞培養液2 mL/孔,繼續常規培養;每24 h同法換液一次;  在藥物處理48 h后,以不含EDTA的胰酶消化并收集細胞于流式管1000 r/min離心5 min,棄上清。冷PBS洗滌細胞3次,離心棄上清;  按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說(shuō)明,向細胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管,振蕩混勻。室溫、避光反應15 min;  再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管,振蕩混勻; 用流式細胞儀檢測細胞凋亡。  


流式細胞儀檢測A549細胞凋亡


    結果判斷  


    凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性,壞死細胞則不能。


    細胞膜有損傷的細胞的 DNA 可被PI著(zhù)染產(chǎn)生紅色熒光,而細胞膜保持完好的細胞則不會(huì )有紅色熒光產(chǎn)生。因此,在細胞凋亡的早期 PI 不會(huì )著(zhù)染而沒(méi)有紅色熒光信號。正?;罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(FITC+/PI-)。
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