流式細胞術(shù)檢測細胞周期
1.實(shí)驗原理 用流式細胞儀檢測細胞周期,通常用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染細胞核。PI在一定波長(cháng)的光下發(fā)出熒光,其強度與DNA含量成正比。通過(guò)流式細胞儀分析各時(shí)期的細胞百分數,可檢測細胞的增殖、凋亡。
實(shí)驗原理
在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側。AnnexinV是一種分子量為35~36 kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。 碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,它不能透過(guò)完整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細胞區分開(kāi)來(lái)。
流式細胞儀檢測A549細胞凋亡
收集對數生長(cháng)期A(yíng)549細胞,計數,以(1~5)×105個(gè)/孔接種于6孔板,置37℃,5%CO2條件下培養過(guò)夜,使細胞貼壁;次日更換培養液,各孔分別加入含有不同濃度茶氨酸的細胞培養液2 mL/孔,繼續常規培養;每24 h同法換液一次; 在藥物處理48 h后,以不含EDTA的胰酶消化并收集細胞于流式管1000 r/min離心5 min,棄上清。冷PBS洗滌細胞3次,離心棄上清; 按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說(shuō)明,向細胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管,振蕩混勻。室溫、避光反應15 min; 再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管,振蕩混勻; 用流式細胞儀檢測細胞凋亡。
結果判斷
凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性,壞死細胞則不能。