在多細胞生物發(fā)育過(guò)程中，一些不需要的細胞會(huì )以一種自主的方式死亡并被機體清除，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為程序性細胞死亡（programmed cell death)。程序性細胞死亡多以細胞凋亡（apoptosis)的機制發(fā)生。除細胞凋亡外，細胞死亡還包括壞死（necrosis)和自噬性細胞死亡（autophagic cell death)等多種死亡形式。在細胞壞死初期，胞質(zhì)內線(xiàn)粒體和內質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，蛋白質(zhì)顆粒增多，進(jìn)而細胞質(zhì)呈現強嗜酸性，經(jīng)蘇木精/伊紅染色后胞質(zhì)呈深伊紅色，細胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏，DNA降解，細胞內容物釋放到胞外，引起周?chē)M織炎癥反應。

    早在20世紀60年代人們就已發(fā)現。當細胞在缺乏營(yíng)養或發(fā)生應激反應時(shí)，可發(fā)生細胞自噬現象，細胞質(zhì)中形成大量自噬泡，由雙層膜包裹著(zhù)待降解物質(zhì)。隨后，自噬泡與溶酶體融合，待降解物質(zhì)經(jīng)酶解后被細胞進(jìn)一步利用。自噬在細胞的生長(cháng)、發(fā)育和疾病發(fā)生中起著(zhù)重要的作用。近來(lái)的研究表明，在某些條件下，細胞自噬也能導致細胞死亡，相應地，細胞凋亡則被稱(chēng)為I型程序性細胞死亡。

    凋亡細胞的基本特征主要包括：胞質(zhì)凝縮，染色質(zhì)聚集及邊緣化，細胞核崩解，細胞以出芽的方式形成凋亡小體，并被鄰近的巨噬細胞等吞噬消化。磷脂酰絲氨酸外翻。凋亡過(guò)程中細胞內溶物不被釋放，故不會(huì )引起炎癥反應。④凋亡細胞中仍存在蛋白質(zhì)的合成反應。⑤內切核酸酶被活化，導致染色質(zhì)DNA在核小體連接處斷裂，形成180~200bp整數倍的核酸片斷，凝膠電泳圖譜呈梯帶狀（DNA ladder)等。

細胞凋亡的檢測方法主要包括以下幾種：

     細胞徑HE、吖啶橙（AO)、Hoechst33342、Hoechst33258染色，利用光境或熒光顯微鏡對細胞形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀(guān)測。其中Hoechst33342/PI雙標記法是檢測細胞凋亡的常規方法。PI是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，由于壞死細胞的膜透性發(fā)生改變，則能被PI染色。Hoechst33342是能能夠與DNA特異結合的具有良好膜通透性的熒光染料，正常細胞、壞死細胞及凋亡細胞的DNA均可被Hoechst33342染色，當細胞經(jīng)Hoechst33342/PI雙染色后，壞死細胞呈PI強陽(yáng)性染色（紅色），而凋亡細胞或正常細胞呈PI低染，利用熒光顯微鏡技術(shù)結合凋亡細胞核形態(tài)的變化就可以將壞死細胞、凋亡細胞和正常細胞區分開(kāi)來(lái)。利用DNA凝膠電泳及DNA片段原位標記法（TURNEL assay）檢測凋亡細胞DNA的斷裂。利用流式細胞儀檢測亞G1期細胞的比例或利用Annexin V、PI聯(lián)合標記法檢測細胞膜磷脂酰絲氨酸翻轉，正?；罴毎鸄nnexin V、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞PI高染。

【實(shí)驗方法與步驟】

    （1）細胞凋亡的誘導：HeLa細胞常規傳代培養至對數生長(cháng)期(見(jiàn)細胞傳代培養）。實(shí)驗組細胞加入順鉑溶液（生理鹽水配置）至終濃度為20μmo1/L,37℃，5% CO2條件下繼續培養?？瞻讓?shí)驗對照加入等體積的生理鹽水，同樣條件繼續培養。24h后進(jìn)行染色及形態(tài)學(xué)觀(guān)察。

    （2）胰酶消化細胞，將培養基上清及消化下來(lái)的細胞一同轉入離心管中600~800r/min離心10min。

    （3）吸去上清，用1mL PBS重懸細胞沉淀，并轉入1.5mL微量離心管中，600~800r/min離心10min。

    （4）吸去上清，用500μL PBS重量細胞沉淀，取178μL轉入0.5mL的微量離心管中，加入PI 20μL（終濃度100μg/mL），Hoechest 33342 2μL（終濃度10μg/mL），混勻，37℃溫箱中避光標記15min。

    （5）600~800r/min離心10min，棄上清，加50μL PBS重懸細胞。

    （6）分別從實(shí)驗組及對照組中取10μL細胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片。

    （7）熒光顯微鏡20倍物鏡在紫外光激發(fā)下觀(guān)察，可觀(guān)察到凋亡細胞核形態(tài)發(fā)生明顯的改變，出現染色質(zhì)凝集及邊緣化。

【注意事項】

    （1）誘導細胞凋亡后收集細胞時(shí)，注意要同時(shí)收集細胞培養基上清液。

    （2）懸浮細胞時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免損傷細胞。

    （3）在實(shí)驗中可同時(shí)設計壞死細胞的對照，例如，取正常細胞經(jīng)低滲后進(jìn)行染色觀(guān)察。