細胞凋亡檢測可以：（1）用于腫瘤細胞和組織在內的不同種類(lèi)病理標本研究；（2）應用于臨床診療，新藥研制、生物制品開(kāi)發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；（3）對相關(guān)疾病的早期發(fā)現、放化療的療效評價(jià)具有舉足輕重的地位。

詳細：熒光探針雙標記法形態(tài)學(xué)檢測法DNA ladder法Annexin V/PI雙染色法磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）TUNEL法Caspase-3活性檢測法
 

實(shí)驗方法原理：
本實(shí)驗用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導培養的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進(jìn)行雙重染色，可以區別凋亡、壞死及正常細胞。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內作用2小時(shí)，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現出典型的凋亡特征。
 
細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過(guò)質(zhì)膜。當細胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細胞內部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著(zhù)色，凋亡細胞和活細胞不著(zhù)色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細胞，因而可進(jìn)行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結合（主要結合于A(yíng)-T）堿基區），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。
實(shí)驗材料 人早幼粒白血病HL-60細胞
試劑、試劑盒 三尖杉酯堿Tris-HclEDTA緩沖液堿性裂解液SDS醋酸鈉異丙醇乙醇溴酚藍蔗糖指示劑TBE電泳緩沖液瓊脂糖溴乙錠PI母液Ho33342母液
儀器、耗材 熒光顯微鏡電泳儀電泳槽微量加樣器離心管載玻片蓋玻片

 實(shí)驗步驟 ：

 一、試劑準備
1.  三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

3.  EDTA緩沖液：5mol/L；

4.   堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

5.  醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

6.  PI母液：500μg/ml；

7.  Ho33342母液：2mmol/L；

8.  人早幼粒白血病HL-60細胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培養基在37℃，5% CO2條件下培養。

9.  其他：異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。
  
二、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細胞凋亡
 
1.  實(shí)驗前約24小時(shí)，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6 ml培養液，置37℃，5%CO2培養箱培養。
 
2.  實(shí)驗前約2.5小時(shí)，當細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5小時(shí)。
 
3.  Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞
 
（1）染色：將瓶中的細胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分鐘。
 
（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10 μl，加入小室內蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀(guān)察，區別三種細胞，并注意三者比例。
  
注意事項： 
 
1.  誘導培養HL-60細胞時(shí)間要準確；
 
2.  熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞時(shí)，由于熒光易碎滅，觀(guān)察時(shí)要盡量快。
 
細胞死亡根據其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區分為凋亡和壞死兩種不同類(lèi)型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著(zhù)非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過(guò)程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。
 
在形態(tài)上可見(jiàn)凋亡細胞與周?chē)毎撾x接觸，細胞變園，細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月?tīng)罘植?、內質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進(jìn)一步融合將細胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過(guò)程中細胞內容物并不釋放到細胞外，不會(huì )影響其它細胞，因而不引起炎癥反應。
 
在生物化學(xué)上，多數細胞凋亡的過(guò)程中，內源性核酸內切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數的各種片斷。如果對核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。
 
相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內容物，引起炎癥反應，壞死過(guò)程中細胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長(cháng)度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。
 
一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡，通常這些因素在誘導凋亡的同時(shí)，也可產(chǎn)生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。