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動(dòng)物DNA提取實(shí)驗


動(dòng)物肝臟DNA提取可以:(1)用于法醫學(xué)鑒定;(2)診斷和系統發(fā)育研究;(3)用于進(jìn)一步的聚合酶鏈式反應(PCR)以獲得DNA。

 

實(shí)驗方法原理;


 在濃氯化鈉(1-2 mol/L)溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小,在稀氯化鈉(0.14 mol/L)溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液,將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來(lái)。
 
將抽提得的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸鈉)處理,DNA或(RNA)即與蛋白質(zhì)分開(kāi),可用氯仿―異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去,而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇,DNA即析出。
 
為了防止DNA或(RNA)酶解,提取時(shí)加入EDTA(乙二胺四乙酸)。


實(shí)驗材料 :小白鼠肝臟
試劑、試劑盒: NaClEDTA-NaSDS檸檬酸三鈉氯仿―異戊醇混合液乙醇二苯胺無(wú)水乙醇過(guò)氯酸
儀器、耗材: 勻漿器離心機量筒吸管水浴鍋真空干燥器


實(shí)驗步驟:


 一、試劑配制
 
1.  5 mol/L NaCl 溶液:將292.3 g NaCl 溶于水,稀釋至1 000 ml。
 
2.  0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na 溶液: 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA-Na 于蒸餾水,稀釋至1 000 ml。
 
3.  25% SDS 溶液: 溶25 g 十二烷基硫酸鈉于100 ml 45% 乙醇。
 
4.  0.015 mol/L  NaCl 0.0015 mol/L 檸檬酸三鈉溶液: 氯化鈉 0.828 g及檸檬酸三鈉0.341 g 溶于蒸餾水,稀釋至1 000 ml。
 
5.  氯仿-異戊醇混合液:氯仿:異戊醇=24:1(V/V)。
 
6.  1.5 mol/L NaCL-0.15 mol/L檸檬酸三鈉溶液:氯化鈉 82.8 g 及檸檬酸三鈉34.1 g溶于蒸餾水,稀釋至1 000 ml。
 
7.  3 mol/L乙醇鈉 0.001 mol/L EDTA-Na溶液: 稱(chēng)取乙酸鈉 408 g,EDTA-Na 0.372g 溶于蒸餾水,稀釋至1 000 ml。
 
8.  70%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,無(wú)水乙醇。
 
9.  1 mol/L過(guò)氯酸溶液:將10 ml 過(guò)氯酸(70%)用蒸餾水稀釋至110 ml。
 
二、 DNA的分離純化
 
1.  將10頭小白鼠迅速殺死,取出肝臟,用0.14 mol/L NaCl 0.15mol/l EDTA溶液洗去血漿,剪碎,加入50 ml 0.14mol/L NaCl -0.15 mol/L EDTA溶液,置勻漿器中研磨,待磨成糊狀后,將糊狀物離心10分鐘(4 000 r/min),棄去上清液,沉淀用0.14 mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次,所得沉淀為脫氧核糖核蛋白粗制品。
 
2.  向上述沉淀物加入0.14 mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液,使總體積為44 ml,然后滴加25% SDS溶液 3 ml,邊加邊攪拌,加畢,置60水浴保溫10分鐘(不停攪拌)溶液變的粘稠并略透明,取出冷至室溫。此步操作是使核酸與蛋白質(zhì)分離。
 
3.  加入5 mol/LNaCl 10 ml,使NaCl 最終濃度達到1 mol/L,攪拌10分鐘,加入約一倍體積的氯仿―異戊醇混合溶液,振搖20分鐘,離心10分鐘(4 000 r/min)。去掉沉淀,上層清液徐徐加入1.5-2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻棒慢慢攪動(dòng),則DNA絲狀物即纏在玻棒上。
 
4.  將DNA粗品置于27 ml  0.015 mol/L  NaCl -0.0015 mol/L檸檬酸三鈉溶液中,再加入3 ml 1.5 mol/L NaCl-0.15 mol/L檸檬酸三鈉溶液,攪勻,加入一倍體積氯仿―異戊醇混合液,振搖十分鐘,離心(4 000 r/min,10分鐘),傾出上層液體(沉淀棄去),加入1.5倍體積95%乙醇,DNA即沉淀析出。離心,棄去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步驟重復處理一次。
 
5.  將上步所得沉淀于27 ml  0.015 mol/L  NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸三鈉溶液中,然后以線(xiàn)狀徐徐加入2倍95%乙醇,邊加邊攪,取出絲狀DNA,依次用70%,80%,95%以及無(wú)水乙醇各洗一次,真空干燥。

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