實(shí)驗背景
生長(cháng)曲線(xiàn)是細胞數量隨培養時(shí)間而變化的曲線(xiàn)??煞譃閹讉€(gè)階段:
潛伏期:即細胞對傳代操作所致?lián)p傷的恢復期或對新生長(cháng)環(huán)境的適應期。細胞修復自身?yè)p傷,熟悉新環(huán)境,恢復生長(cháng)。原代培養細胞潛伏期較長(cháng),一般24-96h或更長(cháng)。連續培養細胞系潛伏期短,一般6-24h。
指數生長(cháng)期,或稱(chēng)對數生長(cháng)期:是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段,培養物中的細胞呈指數生長(cháng)。指數生長(cháng)期內細胞增值活動(dòng)的程度可以作為判斷細胞生長(cháng)是否旺盛的重要指標。常以有絲分裂指數(MI)、細胞群體倍增時(shí)間來(lái)表示。指數生長(cháng)期時(shí)細胞一代中活力最好的時(shí)期,因此是進(jìn)行各種實(shí)驗的主要階段。
停滯期也指平臺期:細胞經(jīng)過(guò)指數生長(cháng)期后達到較高的密度,培養基中的養分也消耗較大,培養液中代謝廢物積聚較多,細胞不再分裂增殖,細胞數量維持在某一水平上,生長(cháng)活動(dòng)停滯。但細胞人存在代謝活動(dòng),此時(shí),若要使細胞恢復生長(cháng),應該立即傳代。
生長(cháng)曲線(xiàn)的測定是測定細胞絕對生長(cháng)數的常用方法,也是判定細胞活力的重要指標,是培養細胞生物學(xué)特性的基本參數之一。除使用計數法測定細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)外,還可以可以使用MTT比色法。其原理是:MTT被活細胞中的線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶還原后,生成暗藍色甲瓚(Formazan),甲瓚被助溶劑溶解后,可在酶標儀上于570nm處讀取OD值,在一定范圍內OD值與活細胞數量呈線(xiàn)性關(guān)系。因此,OD值可間接地反應活細胞的狀態(tài)。接種培養細胞后每天定時(shí)去除細胞,驚喜MTT檢測,可以得到細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。用MTT發(fā)可以檢測某些藥物作用下細胞生長(cháng)活力的變化,靜兒評價(jià)藥物對細胞存貨和生長(cháng)的作用。測定細胞生長(cháng)的另一個(gè)指標是有絲分裂指數,為計數1000個(gè)細胞中分裂細胞數,可以檢測細胞增殖旺盛的程度。
細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的繪制(MTT法)
1、 無(wú)菌培養實(shí)驗室準備(同細胞傳代培養),從CO2培養箱中去除細胞,棄去培養液,加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞,棄去胰蛋白酶液,使用新的含10%小牛血清的培養基制成細胞懸液后計數。
2 、按照4×103細胞/孔接種于96孔板,0.2ml培養基/孔(如果是懸浮細胞,則0.1ml培養基/孔),做傳代培養。設置3個(gè)空白對照孔,只加無(wú)細胞的培養基。
3、 24h后加入待檢藥品,可加入幾種不同濃度的待檢藥品。對照組不加藥,24h時(shí)選取其中3個(gè)孔更換新鮮培養基100ul,加入0.01ml的MTT(5mg/ml)放回37℃孵育4h,之后加入100ul的裂解液,
37℃過(guò)夜。
4 、5天后統一在酶標儀上于570nm下檢測,得出OD值(或者加入裂解液后過(guò)夜每天檢測)。以空白對照調節零點(diǎn)。
注意事項:
1 、接種細胞要準確,接種時(shí)要充分使細胞混勻,防止細胞沉淀造成細胞接種不均。
2 、MTT溶液見(jiàn)光后顏色會(huì )逐漸變深,因此在加入裂解液后96孔培養板應避光孵育/處理。
3 、可以在全部MTT實(shí)驗做完后一起上機檢測OD值,但前提是前面已經(jīng)做完了的須避光處理。也可采取加入裂解液后每天檢測一次OD值,但使用的酶標儀應該性能穩定,隔天檢測結果應一致。