細胞在腫瘤、病毒、細菌、寄生蟲(chóng)、移植組織、過(guò)敏原、甚至自身抗原的適應性免疫應答中都發(fā)揮著(zhù)重要的調節作用。大部分 T 淋巴細胞在其細胞表面表達單一的、高度特異性的抗原受體（TCR），與 MHC-抗原肽復合物相結合并識別其中特異的抗原肽，啟動(dòng)獲得性/特異性免疫應答機制，比如 T 細胞介導的細胞免疫和 B 細胞介導的體液免疫。


      由于 TCR 與 MHC-抗原肽復合物之間的親和力低，半衰期短，相互結合后容易快速脫落，重組的可溶性 MHC-抗原肽復合物單體并不適合用于抗原特異性的 T 細胞檢測。


      1996 年，美國斯坦福大學(xué) John D. Altman 博士等人開(kāi)發(fā)出 MHC-抗原肽復合物四聚體（簡(jiǎn)稱(chēng)：MHC 四聚體）技術(shù)。該技術(shù)由 4 個(gè) MHC-抗原肽單體分子及熒光染料組成的復合物，它以帶有信號標記的鏈霉親合素為基礎，交聯(lián)四個(gè) MHC 分子單體，形成 MHC 四聚體；一個(gè) MHC 四聚體分子可與同一 T 細胞表面的 3-4 個(gè) TCR 相識別并結合，從而大大增強了 MHC-抗原肽復合物與 TCR 之間的結合力和檢測特異性，并可通過(guò)流式細胞術(shù)成功實(shí)現對抗原特異性的 T 細胞的離體分析。

      如今，MHC 四聚體技術(shù)已成為 T 細胞免疫應答定量的「金標準」。它極高的靈敏度和抗原特異性，適用于一些相關(guān)的基礎研究和臨床應用，包括：特異性 T 細胞高效分選；抗原表位短肽親和力篩選；病毒逃避免疫機制研究；T 細胞表面受體 TCR 親和力研究；可作為分子標記，應用于「T-Cell Receptor-Like Antibodies」篩選研究；MHC 免疫功能研究等。


      MHC 四聚體已廣泛應用于疫苗研發(fā)；細胞治療研究等。并具備診斷試劑開(kāi)發(fā)潛能。


四聚體技術(shù)優(yōu)勢

      與其他應用于 T 細胞檢測的傳統方法相比，如酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測（ELISPOT）、單細胞 PCR 等，MHC 四聚體分析技術(shù)具有以下優(yōu)勢：

      高靈敏度：可檢測血液中低豐度（≤1%）的抗原特異性 T 細胞


      高特異性：極大提高了 TCR 與 MHC-抗原多肽復合物結合的特異性


      穩定性好：檢測結果一致性好，可重復性高


      多樣化/個(gè)性化：可定制，合成特異的抗原多肽片段，組合成各種 T 細胞選擇性 MHC 四聚體


      定性/定量分析：可結合流式細胞術(shù)實(shí)現對抗原特異性 T 細胞群的定性/定量分析


      熒光標記選擇靈活： 可選用 PE 或者 APC 標記


HelixGen MHC 四聚體試劑染色步驟

（一）所需主要試劑和設備

      1）欲檢測的細胞或全血；


      2）熒光染料標記 Anti-CD8 抗體或其它抗體；


      3）離心機、流式細胞分選儀等。


（二）基本操作流程


細胞準備


      1.外周血單核細胞、脾細胞、淋巴細胞、常規細胞系細胞等，以 2-5×107/ml 的密度重懸于 FACS Buffer（PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 疊氮鈉；建議使用時(shí)新鮮配制），制備成細胞懸浮液。


      2.取 25ul 細胞懸浮液滴加入微孔培養板或 FACS 試管。


Staining Cocktail 制備


      3.制備 2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC 四聚體（建議稀釋比例為 1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC 抗體或其他用作內參的抗體（請參考其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)?br />

染色孵育


      4.取 25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步驟 2 中的微孔培養板或 FACS 試管，與細胞懸浮液混勻。（注意：使用移液器輕柔上下吹打混勻，盡可能避免產(chǎn)生氣泡。）5.在冰上或其他已通過(guò)實(shí)驗優(yōu)化確認的最佳溫度條件下，避光孵育 60 分鐘。


洗滌


      6、加入 150ul FACS Buffer 至微孔培養板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 試管，輕柔混勻，避免形成氣泡，1200 rpm 離心 5 min，小心除去上清液，盡可能不要觸碰到細胞沉淀，減少細胞損失。（注意：對于具有傳染性或危害性的樣本，可考慮使用吸引器，輕柔吸掉上清液，盡可能不要觸碰到細胞沉淀，減少細胞損失。）


      7、重復步驟 6，再洗滌 2 次。


細胞固定&流式分析


      8、將細胞重懸于 200ul 固定液（PBS+1% 多聚甲醛（PFA））中，使用流式細胞儀進(jìn)行樣本分析。


HelixGen MHC 四聚體試劑染色注意事項


      1.染色體系的體積應盡可能小，以節約試劑。例如：25ul 2X Staining Cocktail + 25ul 細胞懸浮液=50ul。


      2.所有操作應盡量在 4℃ 條件下進(jìn)行。一些 MHC 四聚體在室溫或更高溫度條件下，能獲得更高強度的親和力，可提高染色效果。但另一些細胞表面標志物，比如 CD62L，對較高的溫度條件往往比較敏感。部分 MHC 四聚體已被證實(shí)，在 37℃ 條件下容易與細胞解離。故我們建議：在 4℃ 條件下孵育 45-60 分鐘，或在室溫條件下孵育 30 分鐘。


      3.在進(jìn)行大規模試驗前，建議先進(jìn)行預試驗，以確定最佳的 MHC 四聚體稀釋比例。通常，建議 MHC 四聚體的初始稀釋比例為 1:100～1:200。請根據具體實(shí)驗，優(yōu)化其稀釋比例，以期獲得最佳的染色效果。


      4.對于新鮮的外周血單核細胞、淋巴細胞、脾細胞，通常建議每個(gè)染色樣品細胞總數為 1-2 ×106；而對于細胞克隆或者 CTL 細胞系，每個(gè)樣品細胞總數可減低為 2×105。當針對細胞克隆染色時(shí)，建議選取具有不同特異性的其它克隆細胞作為陰性對照。


      （本文轉載：丁香園）