如何把細胞養得更漂亮
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發(fā)布時(shí)間：2017-09-14
養了很久的細胞，有一些經(jīng)驗和體會(huì )總結一下，和大家分享一下。關(guān)于如何把細胞養的形態(tài)很好更漂亮。
??1.不同的細胞，喜歡的環(huán)境是不一樣的。??這個(gè)不僅僅是說(shuō)培養基的不同，還有就是細胞生長(cháng)的空間密度問(wèn)題。??有一些細胞是數量多一點(diǎn)比較好生長(cháng)，生長(cháng)狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長(cháng)速度慢的細胞。譬如內皮細胞。而有一些是細胞是數量少一點(diǎn)細胞狀態(tài)會(huì )生長(cháng)的比較好，譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。尤其是巨噬細胞，生長(cháng)速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時(shí)就應該留很少量的細胞，這樣細胞狀態(tài)會(huì )比較好。并且巨噬細胞比較喜歡扎堆生長(cháng)，而堆與堆之間是有空間的。如果長(cháng)成相連在一起的一滿(mǎn)片的時(shí)候，細胞形態(tài)基本上就會(huì )差了，老化的會(huì )比較多，對后期實(shí)驗結果是不好的。所以在養細胞的時(shí)候應該摸索該細胞喜歡的生長(cháng)空間密度問(wèn)題。
??2.對于有些人總是會(huì )遇到養的細胞形態(tài)怎么都不好的問(wèn)題。這個(gè)其實(shí)是有一個(gè)方法可以改善的。對于貼壁細胞，如果細胞形態(tài)不好，（或者細胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等）可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作：??首先，倒掉舊的培養基，加入3ml新的培養基（有無(wú)血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培養基，進(jìn)行預吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著(zhù)瓶底過(guò)一遍，然后吸走。這時(shí)侯再開(kāi)始正式的消化、吹打。（巨噬細胞我們只吹打，不消化的）??其次，把吹打下來(lái)的細胞懸液加入到新的培養瓶?jì)?，培養瓶事先加入培養基，放入培養箱內培養，按時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察細胞貼壁情況。10分鐘觀(guān)察一次，20分鐘，30分鐘觀(guān)察一次。選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，已經(jīng)有部分細胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養基，加入3ml新培養基再輕輕洗一次。然后加入完全培養基培養。后續觀(guān)察細胞生長(cháng)情況以及形態(tài)。我稱(chēng)之為“二傳”。呵呵。??如果一次效果還不理想，可重復多次。直到找到細胞完美形態(tài)。其中要注意，結合細胞喜歡的生長(cháng)情況。喜歡多一點(diǎn)數量長(cháng)得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳。反之亦然。這個(gè)是我師兄發(fā)明的，謝謝他了。這個(gè)方法真的很好用！
??3.關(guān)于培養瓶?jì)燃尤肱囵B基的量的問(wèn)題。??這個(gè)是要靠自己去摸索你所養的細胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些細胞反而是培養基少一點(diǎn)相反細胞形態(tài)會(huì )長(cháng)得比較好。（可能也是競爭很大，有優(yōu)勝劣汰吧。呵呵。）對于生長(cháng)速度快的細胞，易生長(cháng)的細胞加少一點(diǎn)培養基細胞形態(tài)會(huì )更好。但是要注意換液掌握。
??4.關(guān)于選擇培養瓶的問(wèn)題。??個(gè)人發(fā)現生長(cháng)速度快的細胞在玻璃瓶?jì)壬L(cháng)的狀態(tài)會(huì )比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞，在其生長(cháng)旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶?jì)鹊纳L(cháng)狀態(tài)也比塑料瓶?jì)群?。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長(cháng)速度快的細胞在塑料瓶這種相對“更安逸”的環(huán)境里反而長(cháng)得狀態(tài)不如玻璃瓶好。??所以對于生長(cháng)速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會(huì )好，對于生長(cháng)速度慢的細胞，玻璃瓶則會(huì )更好。同樣，對于同一種細胞，在其生長(cháng)速度慢的時(shí)候，塑料瓶會(huì )好一點(diǎn)，比如剛剛復蘇的時(shí)候，或者原代培養的時(shí)候。而在其生長(cháng)旺盛的時(shí)候，玻璃瓶則相對會(huì )好一點(diǎn)。
5.傳代時(shí)消化的問(wèn)題。可以這樣說(shuō)，對于需要消化傳代的細胞，每一次的消化都是對這個(gè)細胞存活與否，狀態(tài)好與不好最至關(guān)重要的考驗。很多同學(xué)都遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題，自己養的細胞開(kāi)始的幾代長(cháng)的還挺好的，可是穿過(guò)幾代之后就發(fā)現自己的細胞不行了，狀態(tài)越來(lái)越差勁了。對于這個(gè)問(wèn)題，可以非?？隙ǖ卣f(shuō)，你的消化環(huán)節出問(wèn)題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以，越長(cháng)越差。
在消化的過(guò)程中，你加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著(zhù)，但是我們忽視了一個(gè)問(wèn)題就是，細胞的生長(cháng)狀態(tài)是不一樣的，每一個(gè)細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒(méi)有那么牢固的，所以，讓所有的細胞消化同樣的時(shí)間對細胞是不公平的，他們受到了差別待遇當然會(huì )有脾氣啊。。。呵呵。我后來(lái)對消化的方法進(jìn)行了改良。爭取做到因材施教呵呵。我稱(chēng)之為“四步消化法”。（以難消化細胞為例）
具體操作：
1）.首先不加胰酶，倒掉舊培養基加入少量新培養基洗1-2遍，（這是前奏，即為第一步，目的是將漂浮著(zhù)的死細胞之類(lèi)盡量洗掉。
2）.然后再加入少量新培養基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來(lái)。再用培養基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。即為第二步（你可以將這些傳入新瓶培養，以與后面胰酶消化過(guò)的細胞對比觀(guān)察看誰(shuí)長(cháng)的更好一點(diǎn)就知道該細胞對胰酶的敏感度了。）
3）.吸干凈瓶?jì)仁Ｓ嘁后w，加入0.3ml左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀(guān)察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養基開(kāi)始吹打，吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用2ml左右新培養基洗一遍與前面的混合。（你也可以傳入新瓶培養，以與后面及前面的做對比。）這是第三步。
4）.然后把前面剛吸出來(lái)的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話(huà)，呵呵。繼續鏡下觀(guān)察，待剩余細胞間隙明顯，細胞獨立開(kāi)來(lái)的時(shí)候，吸掉胰酶，加入新培養基吹打。懸液傳入新瓶培養（根據實(shí)際情況你自己把握）。這是第四步。
其實(shí)還可以有第五步，對于特別難消化的細胞和對胰酶特別敏感的細胞的話(huà)，你可以繼續加第五步甚至第六步。為了細胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒(méi)辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能最大限度地將胰酶對細胞的損傷降到最低，保證細胞的狀態(tài)能夠最優(yōu)。
當然了，如果細胞是屬于那種很容易消化的細胞，像RAW264.7，僅僅第二步就搞定了。就沒(méi)必要第三步第四步了。這個(gè)是需要你在實(shí)驗中能夠自己用心去體會(huì )的。建議你接受一個(gè)新細胞時(shí)把各步消化的細胞分別培養起來(lái)做比較，去摸索好細胞對胰酶的要求。便于你后續實(shí)驗的開(kāi)展。
將細胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以最大程度地把細胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài)，不成片不連體。
因為細胞生長(cháng)的時(shí)候肯定是要相互聯(lián)系，大部分的細胞都是要成片生長(cháng)的，尤其是對于貼壁細胞，單個(gè)細胞貼壁之后長(cháng)著(zhù)長(cháng)著(zhù)就長(cháng)到一片去了。但是如果是成片的細胞抱團的話(huà)，傳代后細胞是不能貼壁的，這樣抱團的細胞就會(huì )死亡。所以，消化傳代的時(shí)候一定要將細胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨立狀態(tài)，這個(gè)啊是非?？季磕愕墓Ψ虻?！
細胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個(gè)，因為他沒(méi)有受力點(diǎn)了。很難找到受力點(diǎn)讓你對他吹打的力分散開(kāi)細胞。所以必須要在細胞未脫落之前將其吹打開(kāi)，受力點(diǎn)就是細胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴格控制好消化的程度啊，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理啊。既要消化到容易吹打下來(lái)，又不能太過(guò)，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(cháng)狀態(tài)貼壁程度的細胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開(kāi)。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。尤其是對于某些細胞這一點(diǎn)就是他活去死的致命點(diǎn)。像Caco-2細胞就是如此。
另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細胞長(cháng)滿(mǎn)的時(shí)候才去消化傳代。要在細胞長(cháng)到70%左右的時(shí)候就要傳代了，一旦發(fā)現細胞生長(cháng)中已經(jīng)有疊層生長(cháng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代。不能再拖了。
6.關(guān)于換液傳代時(shí)候洗瓶的問(wèn)題。這個(gè)發(fā)現吧沒(méi)有經(jīng)過(guò)大規模驗證呵呵。對于用DMEM培養基培養的細胞，你在洗的時(shí)候如果是用無(wú)血清1640去洗細胞在隨即后的幾次中會(huì )比用DMEM洗的長(cháng)的要好。同樣，用1640培養的也有這個(gè)現象。如果不嫌麻煩的話(huà)，可以用PBS來(lái)洗，洗的效果和用無(wú)血清培養基洗的效果基本上是一樣的，對于有些細胞會(huì )更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養瓶里殘留的血清，防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。
先補充這么多，還會(huì )后續更新。
更新：
再補充一點(diǎn)：傳代時(shí)PBS洗是很重要的一步，最近發(fā)現，用PBS就可以把細胞消化開(kāi)來(lái)。加入PBS放置10-15分鐘，有些需要更長(cháng)的時(shí)間，等到細胞一個(gè)個(gè)分離開(kāi)來(lái)的時(shí)候，就可以直接吹打下來(lái)，但是和胰酶消化一樣，要控制好時(shí)間，不能時(shí)間太過(guò)了，要不然損傷細胞，細胞不容易成活，狀態(tài)容易不好。這個(gè)方法對于某些細胞是很管用的。有些細胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候，或者臨時(shí)沒(méi)有胰酶了，可以選用此方法。不過(guò)一定要試試，看是否適合你的細胞。
（本文轉載：丁香通）
