細胞周期的測定
一、原理
二、儀器、用品與試劑
三、操作步驟
1、細胞生長(cháng)至指數期時(shí),向培養液中加入BrdU,使最終濃度為10μg/ml?! ?/span>
2、44小時(shí)加秋水仙素,使每ml中含0.1μg?! ?/span>
3、48小時(shí)后常規消化細胞至離心管中,注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中?! ?/span>
4、常規染色體制片(見(jiàn)第三部分:染色體技術(shù))?! ?/span>
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘?! ?/span>
6、棄去2×SSC液,流水沖洗?! ?/span>
7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干?! ?/span>
8、鏡檢100個(gè)分裂相,計第一、二、三、四細胞期分裂指數?! ?/span>
9、計算:細胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時(shí))
附:
(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存?! ?/span>
(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉-2H2O0.88克,加水至100ml,4℃保存。
細胞的凍存和復蘇
一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時(shí),細胞內和外環(huán)境中的水都會(huì )形成冰晶,能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑,可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結條件下,能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時(shí)速度要快,使之迅速通過(guò)細胞最易受損的-5~0℃,細胞仍能生長(cháng),活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細胞無(wú)毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細胞。
(本文轉載:丁香通)