以下是根據NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細胞培養protocol整理而成。根據經(jīng)驗作部分修改。

1、一般培養：保持胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)

2 、體外分化

體外分化方法

一般培養

      維持ES細胞處于未分化狀態(tài)

培養基

ES：

      配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養基--見(jiàn)下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過(guò)將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基，0.22 μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃，時(shí)間不要超過(guò)2周。貯存液       DMEM(高糖)       馬血清（HS）       L-谷氨酰胺（200mM）       MEM NEAA（10mM）       HEPES（1M）       β-巰基乙醇（55Mm）       PEST       LIF

復蘇細胞

      細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會(huì )損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進(jìn)行細胞復蘇是很重要的。

步驟：      

      1、從液氮中取出一管細胞；      

      2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；      

      3、將細胞轉移到一15ml Falcon管中；      

      4、加入5ml ES培養基（用培養基沖洗凍存管）；      

      5、離心3分鐘；      

      6、棄上清，用2ml ES培養基重懸細胞，至少吹打10次；      

      7、接種在明膠包被（見(jiàn)下文）的6孔或6cm組織培養皿；      

      8、孵育。

凍存細胞

      凍存液：90％HS和10％DMSO

步驟：      

      1、1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內；      

      2、用細胞刮刀收集細胞；      

      3、將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘；      

      4、棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養皿用2ml，15cm的培養皿用6－7ml。）      

      5、分裝于凍存管內，每管1ml；      

      6、置－80℃過(guò)夜，第二天移入液氮。

Geltin（明膠）包被

      準備500ml 0.1％geltin溶液      

      1、將0.5 g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。      

      2、最好在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，貯存在4℃。

包被培養板或培養皿      

      1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面（15 cm培養皿加2ml，10 cm培養皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養表面就行了。）；      

      2、置室溫30分鐘；      

      3、去除明膠溶液，將培養板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養板。

細胞傳代

      建議每2天傳代細胞一次，過(guò)度生長(cháng)的細胞會(huì )降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前，通過(guò)將分化細胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。

      1、去除培養液；     

      2、無(wú)鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；      

      3、加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。      

      4、加入ES。培養基使胰酶失活；      

      5、將細胞轉入15 ml離心管中離心3min；      

      6、去除上清，將細胞重懸于2 ml ES培養基，至少吹打10－20次。如果加入培養基的量較少會(huì )比較容易將細胞團弄散分開(kāi)。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過(guò)程中仔細將細胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì )減少細胞的自然分化。      

      7、將細胞接種在沒(méi)有包被的組織培養皿中（使用和一開(kāi)始同樣規格的培養皿）放入溫箱2小時(shí)（分化細胞在該時(shí)間內將黏附，而ES細胞仍將保持懸?。?；      

      8、將含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開(kāi)（前面已經(jīng)提到--ES細胞有聚集成團的傾向）      

      9、建議按1：4－1：10的比率傳代 (ATCC)

      保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規格的培養板進(jìn)行細胞傳代可以使用表1來(lái)計算傳代比率。

      （本文轉載：丁香通）