亚洲国产一级毛片视频-无码人妻久久一区二区三区-国产一级黄色毛片视频-精品中文字幕久久久久久-亚洲精品影院综合在线观看

新浪微博
微信互動(dòng)

小鼠胚胎干細胞培養實(shí)驗步驟



以下是根據NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細胞培養protocol整理而成。根據經(jīng)驗作部分修改。


1、一般培養:保持胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)

      培養基      細胞復蘇      凍存細胞      明膠包被      細胞傳代


2 、體外分化

      培養基      包被有多聚鳥(niǎo)氨酸/纖維結合蛋白的培養板(使用或不使用蓋玻片)


體外分化方法

      注:以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系,其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過(guò)人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol,需要用專(zhuān)用的protocol和培養基。


一般培養


      維持ES細胞處于未分化狀態(tài)

      ES細胞培養用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed細胞的培養基(高糖)來(lái)阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2-3天從達到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細胞一次,細胞傳代以后,在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養皿之前,通過(guò)預先將細胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養板2個(gè)小時(shí),使分化細胞粘附,從而將分化和未分化細胞分開(kāi)。將細胞全程置于37℃,5%CO2,100%濕度條件下培養。如果在Feed細胞,那么就需要采用MMC進(jìn)行處理,抑制Feed細胞增殖,但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來(lái)源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。


培養基


ES:


      配制一20×不含DMEM,HS,LIF的溶液(該溶液也能用于EB培養基--見(jiàn)下文)。分裝在50ml 離心管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。通過(guò)將21ml該溶液,HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基,0.22 μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃,時(shí)間不要超過(guò)2周。貯存液       DMEM(高糖)       馬血清(HS)       L-谷氨酰胺(200mM)       MEM NEAA(10mM)       HEPES(1M)       β-巰基乙醇(55Mm)       PEST       LIF


復蘇細胞


      細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結晶的形成,結晶的形成會(huì )損害細胞。然而,二甲基亞砜對細胞有毒性,快速的進(jìn)行細胞復蘇是很重要的。


步驟:      

      1、從液氮中取出一管細胞;      

      2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內溶液恰好完全溶解);      

      3、將細胞轉移到一15ml Falcon管中;      

      4、加入5ml ES培養基(用培養基沖洗凍存管);      

      5、離心3分鐘;      

      6、棄上清,用2ml ES培養基重懸細胞,至少吹打10次;      

      7、接種在明膠包被(見(jiàn)下文)的6孔或6cm組織培養皿;      

      8、孵育。


凍存細胞


      凍存液:90%HS和10%DMSO


步驟:      

      1、1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內;      

      2、用細胞刮刀收集細胞;      

      3、將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘;      

      4、棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10 cm的培養皿用2ml,15cm的培養皿用6-7ml。)      

      5、分裝于凍存管內,每管1ml;      

      6、置-80℃過(guò)夜,第二天移入液氮。


Geltin(明膠)包被


      準備500ml 0.1%geltin溶液      

      1、將0.5 g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中(50-65℃水浴15~30分鐘)。      

      2、最好在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾,貯存在4℃。


包被培養板或培養皿      


      1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面(15 cm培養皿加2ml,10 cm培養皿加0.5~1 ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆蓋培養表面就行了。);      

      2、置室溫30分鐘;      

      3、去除明膠溶液,將培養板貯存在包裝袋中室溫放置,最好將板子平放或倒扣,以免明膠污染蓋子和流出培養板。


細胞傳代


      建議每2天傳代細胞一次,過(guò)度生長(cháng)的細胞會(huì )降低細胞的自然分化率,我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細胞,在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前,通過(guò)將分化細胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。

      1、去除培養液;     

      2、無(wú)鈣鎂PBS(Gibco)洗滌;      

      3、加入胰酶EDTA(Gibco)。37℃孵育5分鐘。      

      4、加入ES。培養基使胰酶失活;      

      5、將細胞轉入15 ml離心管中離心3min;      

      6、去除上清,將細胞重懸于2 ml ES培養基,至少吹打10-20次。如果加入培養基的量較少會(huì )比較容易將細胞團弄散分開(kāi)。ES細胞有聚集成團的傾向,傳代過(guò)程中仔細將細胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì )減少細胞的自然分化。      

      7、將細胞接種在沒(méi)有包被的組織培養皿中(使用和一開(kāi)始同樣規格的培養皿)放入溫箱2小時(shí)(分化細胞在該時(shí)間內將黏附,而ES細胞仍將保持懸?。?;      

      8、將含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開(kāi)(前面已經(jīng)提到--ES細胞有聚集成團的傾向)      

      9、建議按1:4-1:10的比率傳代 (ATCC)


      保持細胞的傳代比率很重要,以我們的經(jīng)驗,1:8的比率是好的,可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規格的培養板進(jìn)行細胞傳代可以使用表1來(lái)計算傳代比率。


      (本文轉載:丁香通

上一篇:如何優(yōu)化您的免疫細胞培養?
下一篇:神經(jīng)細胞培養
分享到: