以下是根據NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細胞培養protocol整理而成。根據經(jīng)驗作部分修改。
1、一般培養:保持胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)
培養基 細胞復蘇 凍存細胞 明膠包被 細胞傳代
2 、體外分化
培養基 包被有多聚鳥(niǎo)氨酸/纖維結合蛋白的培養板(使用或不使用蓋玻片)
體外分化方法
注:以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系,其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過(guò)人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol,需要用專(zhuān)用的protocol和培養基。
一般培養
維持ES細胞處于未分化狀態(tài)
ES細胞培養用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed細胞的培養基(高糖)來(lái)阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2-3天從達到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細胞一次,細胞傳代以后,在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養皿之前,通過(guò)預先將細胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養板2個(gè)小時(shí),使分化細胞粘附,從而將分化和未分化細胞分開(kāi)。將細胞全程置于37℃,5%CO2,100%濕度條件下培養。如果在Feed細胞,那么就需要采用MMC進(jìn)行處理,抑制Feed細胞增殖,但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來(lái)源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。
培養基
ES:
配制一20×不含DMEM,HS,LIF的溶液(該溶液也能用于EB培養基--見(jiàn)下文)。分裝在50ml 離心管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。通過(guò)將21ml該溶液,HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基,0.22 μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃,時(shí)間不要超過(guò)2周。貯存液 DMEM(高糖) 馬血清(HS) L-谷氨酰胺(200mM) MEM NEAA(10mM) HEPES(1M) β-巰基乙醇(55Mm) PEST LIF
復蘇細胞
細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結晶的形成,結晶的形成會(huì )損害細胞。然而,二甲基亞砜對細胞有毒性,快速的進(jìn)行細胞復蘇是很重要的。
步驟:
1、從液氮中取出一管細胞;
2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內溶液恰好完全溶解);
3、將細胞轉移到一15ml Falcon管中;
4、加入5ml ES培養基(用培養基沖洗凍存管);
5、離心3分鐘;
6、棄上清,用2ml ES培養基重懸細胞,至少吹打10次;
7、接種在明膠包被(見(jiàn)下文)的6孔或6cm組織培養皿;
8、孵育。
凍存細胞
凍存液:90%HS和10%DMSO
步驟:
1、1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內;
2、用細胞刮刀收集細胞;
3、將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘;
4、棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10 cm的培養皿用2ml,15cm的培養皿用6-7ml。)
5、分裝于凍存管內,每管1ml;
6、置-80℃過(guò)夜,第二天移入液氮。
Geltin(明膠)包被
準備500ml 0.1%geltin溶液
1、將0.5 g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中(50-65℃水浴15~30分鐘)。
2、最好在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾,貯存在4℃。
包被培養板或培養皿
1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面(15 cm培養皿加2ml,10 cm培養皿加0.5~1 ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆蓋培養表面就行了。);
2、置室溫30分鐘;
3、去除明膠溶液,將培養板貯存在包裝袋中室溫放置,最好將板子平放或倒扣,以免明膠污染蓋子和流出培養板。
細胞傳代
建議每2天傳代細胞一次,過(guò)度生長(cháng)的細胞會(huì )降低細胞的自然分化率,我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細胞,在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前,通過(guò)將分化細胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。
1、去除培養液;
2、無(wú)鈣鎂PBS(Gibco)洗滌;
3、加入胰酶EDTA(Gibco)。37℃孵育5分鐘。
4、加入ES。培養基使胰酶失活;
5、將細胞轉入15 ml離心管中離心3min;
6、去除上清,將細胞重懸于2 ml ES培養基,至少吹打10-20次。如果加入培養基的量較少會(huì )比較容易將細胞團弄散分開(kāi)。ES細胞有聚集成團的傾向,傳代過(guò)程中仔細將細胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì )減少細胞的自然分化。
7、將細胞接種在沒(méi)有包被的組織培養皿中(使用和一開(kāi)始同樣規格的培養皿)放入溫箱2小時(shí)(分化細胞在該時(shí)間內將黏附,而ES細胞仍將保持懸?。?;
8、將含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開(kāi)(前面已經(jīng)提到--ES細胞有聚集成團的傾向)
9、建議按1:4-1:10的比率傳代 (ATCC)
保持細胞的傳代比率很重要,以我們的經(jīng)驗,1:8的比率是好的,可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規格的培養板進(jìn)行細胞傳代可以使用表1來(lái)計算傳代比率。
(本文轉載:丁香通)