一． 設備： 無(wú)菌操作設備。

二． 大型設備：

      CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。

      倒置顯微鏡：用于每天觀(guān)察貼壁細胞生長(cháng)情況。

      解剖顯微鏡，用于準確地取材。

      常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。

      低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

      電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。

      高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術(shù)器械。

      過(guò)濾器：配制解剖液、培養液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細菌。

      滲透壓儀，pH劑，天平等。

三． 培養器皿及手術(shù)器械

      2 培養板，24-40孔，可用于開(kāi)放培養。

      3 培養瓶。

      4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

      5各類(lèi)培養液貯存器。

      6 小型手術(shù)器械。

準備：

一 配制培養液

      （1） 解剖液：以無(wú)機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

      （2） 基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

      （3） 接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。

      （4） 維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養物質(zhì)。

二 培養基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴(lài)氨酸，再涂膠

三 消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進(jìn)行。

神經(jīng)細胞分散培養

      （一） 選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

      （二） 取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。

      （三） 細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

      （四） 抑制膠質(zhì)細胞生長(cháng)。培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長(cháng)。

      （五） 觀(guān)察。接種6-12h，開(kāi)始貼壁，并有集合現象，細胞生長(cháng)突起明顯，5-7d膠質(zhì)細胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細胞成片于神經(jīng)細胞下面，形成地毯，2周時(shí)神經(jīng)細胞生長(cháng)最豐滿(mǎn)，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細胞開(kāi)始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周最宜。但神經(jīng)細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì )有細胞周期，而且隨培養時(shí)間的延長(cháng)，細胞數量在下降，但膠質(zhì)細胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可以。在培養過(guò)程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長(cháng)而多，且相互形成突觸。

      （六） 常用培養細胞實(shí)驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析；

      但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核內抗原定位時(shí)，首先考慮膜對抗體的通透性問(wèn)題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。在免疫組化中，或其它組織學(xué)染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹(shù)突膠質(zhì)細胞標記明顯；GFAP對星形膠質(zhì)細胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統中膠質(zhì)細胞功能具有極大的應用價(jià)值。神經(jīng)膠質(zhì)細胞以往多被忽視，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷）、退行性疾?。ㄈ鏏D、PD）、損傷后膠質(zhì)細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細胞功能和營(yíng)養支持的物質(zhì)基礎。

      （本文轉載：丁香通）