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轉染常見(jiàn)問(wèn)題分析及解決方案

 

       基因轉染是將具生物功能的核酸(RNADNA)轉移或運送到細胞內,并使核酸在細胞內維持其生物功能的核酸轉移技術(shù)。轉染技術(shù)的目的是主要是研究真核基因的表達和調控,目前的方法包括磷酸鈣共沉淀法,電穿孔法以及同DEAE-dextran或陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑形成復合物法。

 

在這些不同的方法中,DNA轉導的效率,轉導的機制,可重復性及使用的方便性都存在差異。而且,有效的DNA轉導會(huì )伴隨某些毒性或細胞抑制,其程度依賴(lài)于試劑、步驟和目的細胞的不同而不同,因此建議根據實(shí)際條件和實(shí)驗條件,選擇最佳的轉染方法。目前最常見(jiàn)的轉染方法有如下幾種:

 

磷酸鈣共沉淀

將氯化鈣,DNA和磷酸緩沖液混合,沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細胞的細胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗中使用的每種試劑都必須小心校準,保證質(zhì)量,因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì )導致磷酸鈣轉染的失敗。

 

電穿孔法

電穿孔通過(guò)將細胞暴露在短暫的高場(chǎng)強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì )誘導沿細胞膜的電壓差異,據研究認為這種電壓差異會(huì )導致細胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強的優(yōu)化對于成功的轉染非常重要,因為過(guò)高的場(chǎng)強和過(guò)長(cháng)的電脈沖時(shí)間會(huì )不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般,成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平(50%或更高)的毒性。

 

DEAE-葡聚糖和polybrene

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉染。

 

機械法

轉染技術(shù)也包括使用機械的方法,比如顯微注射和基因槍?zhuān)?/span>biolistic particle)。顯微注射使用一根細針頭將DNA,RNA或蛋白直接轉入細胞質(zhì)或細胞核?;驑屖褂酶邏?/span>microprojectile將大分子導入細胞。

   

陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑

將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí),其可以形成微小的(平均大小約100-400nm)單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電,可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑,DNA并沒(méi)有預先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動(dòng)結合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物。有研究報道,一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì )結合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì )被導入培養的細胞。目前對DNA轉導原理的證據主要來(lái)源于內吞體和溶酶體的研究。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導的轉染法,由于轉染效率高,細胞毒性很低,操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),逐漸成為主要的轉染試劑。隨著(zhù)基因表達和調控研究的深入,轉染技術(shù)成為研究中一種重要的實(shí)驗方法,從而推動(dòng)了新一代轉染試劑的研發(fā)和利用。天為時(shí)代公司開(kāi)發(fā)的TRANSfectionTRANS quick基因轉染試劑是最新一代的陽(yáng)離子聚合物轉染試劑的代表,對多種細胞的轉染具有最高的轉染效率。

 

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