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全血細胞培養染色技術(shù)常用試劑配制

一、國內實(shí)驗室應用試劑配制

 

(一)培養液

1RPMI1640培養液:稱(chēng)取RPMI培養基9.8g,碳酸氫鈉1.9g、青霉素100u/ml,加雙蒸水至1000ml,調節 pH7.27.4無(wú)菌過(guò)濾凍存備用。

2)小牛血清商品:成都生物制品廠(chǎng)。

3)植物凝集素(PHA):自制或成品(重慶藥檢所)。

4pH調整液:5%NaHCO 3 溶液高壓滅菌(815min),0.1N稀鹽酸液100ml。

5)秋水仙素:10mg/ml無(wú)菌過(guò)濾高壓滅菌(810min)。

6)磷酸緩沖液:pH7.4。

 磷酸氫二鈉28.8g(H 2 O)、磷酸二氫鉀2.67g(無(wú)水),溶于1000ml雙蒸水中,加肝素,終濃度為100u/ml。

7Giemsa染色液:

 Giemsa粉劑 1g

 甘油 66ml

在研缽中,加入少量甘油油仔細研磨然后放甘油全部加磨,60℃溫箱中保溫2h,冷卻后加入甲醇66ml。裝入有色瓶中混合待用。染色時(shí)用pH7.4磷酸緩沖液稀釋10倍,隨配隨用。

(二)固定液

1)甲酸:冰乙酸31混合即用。

2PBS緩沖液配制:

NaCl 16g Na 2 HPO 4 (12H 2 O) 5.65g

KCl 0.4g KH 2 PO 4 0.4g

加雙蒸水至1000ml pH7.0。

5%胰酶(生理鹽水配制)1ml加入50ml PBS液中(最終濃度為0.025%),4℃冰箱待用。

 

二、 細胞培養 (Bhatl BMcGee JOD,1990

1.完全培養基

RPMI 76.0ml

胎牛血清 20.0ml

植物凝集素 2.0ml

抗生素/抗菌素溶液(100×) 1.0ml

L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml

2.BudR(5-Bromo-2-deoxyuridine, 5--2-脫氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudRdH 2 O中,0.2μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝后-20℃儲存,BudR要在柔光(弱光)下操作。

3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd)  按250μg/ml溶解于dH 2 O中,過(guò)濾后分裝儲存于-20℃。

4Colcemid(Sigma) 5.0μg/ml溶于dH 2 O中,過(guò)濾后分裝儲存于-20℃。

5KCl0.75mol/L)  溶解560mg100ml dH 2 O中,新鮮配制37℃保存。

6.固定劑  甲醇冰醋酸按31V/V)混合即可,現用現配,置冰上待用。

7.缺口平移試劑盒(AmershamBRL公司)

8.生物素7-dATP(BRL)

9.糖原(BRL

10.RNAASigma

 

1)儲備液

稱(chēng)取RNAA 1g溶于100ml醋酸鈉中,置沸水中煮10min,分裝后儲于-20℃。

 

2)工作液

用儲備液按1100稀釋。

11.20×SSC

NaCl 175g

檸檬酸三鈉 88g

dH 2 O 1000ml

固定試劑溶解后,dH 2 O定容至1000ml,調pH7.4,高壓滅菌

 

12.雜交液(高深度,HMmix

去離子甲酰胺 6.0ml

100×Denhardts1.0ml

50%硫酸葡聚糖 2.0ml

1%人或鮭精DNA

20×SSC

※:臨用前加入,終濃度為100200μg/ml。

該液為高濃度雜交液, 存于4℃。

 

13.PBT

BSA 5%

Triston X-100/(PBS) 0.1%

注:BSA液用前應用Whatman 3mm濾紙過(guò)濾。

14.兔抗生物素(α-生物素)單克隆抗體

PBT1100稀釋。

該單抗現可從英國Dako公司購得。

15.金(1020nm)標羊抗兔二抗

PBT150稀釋。

 

16.銀溶液(Janesen

 

17.Hoedst 33258(Sigma

儲備液(100×)

Hoedst染料 5mg

甲醇 10ml

工作液:用2×SSC 1100稀釋儲備液。

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