一、國內實(shí)驗室應用試劑配制
(一)培養液
(1)RPMI1640培養液:稱(chēng)取RPMI培養基9.8g,碳酸氫鈉1.9g、青霉素100u/ml,加雙蒸水至1000ml,調節 pH7.2~7.4無(wú)菌過(guò)濾凍存備用。
(2)小牛血清商品:成都生物制品廠(chǎng)。
(3)植物凝集素(PHA):自制或成品(重慶藥檢所)。
(4)pH調整液:5%NaHCO 3 溶液高壓滅菌(8磅15min),0.1N稀鹽酸液100ml。
(5)秋水仙素:10mg/ml無(wú)菌過(guò)濾高壓滅菌(8磅10min)。
(6)磷酸緩沖液:pH7.4。
磷酸氫二鈉28.8g(H 2 O)、磷酸二氫鉀2.67g(無(wú)水),溶于1000ml雙蒸水中,加肝素,終濃度為100u/ml。
(7)Giemsa染色液:
Giemsa粉劑 1g
甘油 66ml
在研缽中,加入少量甘油油仔細研磨然后放甘油全部加磨,60℃溫箱中保溫2h,冷卻后加入甲醇66ml。裝入有色瓶中混合待用。染色時(shí)用pH7.4磷酸緩沖液稀釋10倍,隨配隨用。
(二)固定液
(1)甲酸:冰乙酸3:1混合即用。
(2)PBS緩沖液配制:
NaCl 16g Na 2 HPO 4 (12H 2 O) 5.65g
KCl 0.4g KH 2 PO 4 0.4g
加雙蒸水至1000ml pH7.0。
取5%胰酶(生理鹽水配制)1ml加入50ml PBS液中(最終濃度為0.025%),4℃冰箱待用。
二、 細胞培養 (Bhatl B和McGee JOD,1990)
1.完全培養基
RPMI 76.0ml
胎牛血清 20.0ml
植物凝集素 2.0ml
抗生素/抗菌素溶液(100×) 1.0ml
L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml
2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脫氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH 2 O中,0.2μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝后-20℃儲存,BudR要在柔光(弱光)下操作。
3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd) 按250μg/ml溶解于dH 2 O中,過(guò)濾后分裝儲存于-20℃。
4.Colcemid(Sigma) 5.0μg/ml溶于dH 2 O中,過(guò)濾后分裝儲存于-20℃。
5.KCl(0.75mol/L) 溶解560mg于100ml dH 2 O中,新鮮配制37℃保存。
6.固定劑 甲醇冰醋酸按3:1(V/V)混合即可,現用現配,置冰上待用。
7.缺口平移試劑盒(Amersham和BRL公司)
8.生物素7-dATP(BRL)
9.糖原(BRL)
10.RNA酶A(Sigma)
(1)儲備液
稱(chēng)取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸鈉中,置沸水中煮10min,分裝后儲于-20℃。
(2)工作液
用儲備液按1:100稀釋。
11.20×SSC
NaCl 175g
檸檬酸三鈉 88g
dH 2 O 1000ml
固定試劑溶解后,dH 2 O定容至1000ml,調pH至7.4,高壓滅菌
12.雜交液(高深度,HMmix)
去離子甲酰胺 6.0ml
100×Denhardt’s液 1.0ml
50%硫酸葡聚糖 2.0ml
1%人或鮭精DNA ※
20×SSC
※:臨用前加入,終濃度為100~200μg/ml。
該液為高濃度雜交液, 存于4℃。
13.PBT液
BSA 5%
Triston X-100/(PBS) 0.1%
注:BSA液用前應用Whatman 3mm濾紙過(guò)濾。
14.兔抗生物素(α-生物素)單克隆抗體
用PBT液1:100稀釋。
該單抗現可從英國Dako公司購得。
15.金(10~20nm)標羊抗兔二抗
用PBT液1:50稀釋。
16.銀溶液(Janesen)
17.Hoedst 33258(Sigma)
儲備液(100×)
Hoedst染料 5mg
甲醇 10ml
工作液:用2×SSC 1:100稀釋儲備液。