一、免疫組化的作用

   組織或細胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進(jìn)行檢測。

二、免疫組化原理

   應用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應，通過(guò)化學(xué)反應來(lái)確定組織細胞內抗原，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。隨著(zhù)免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規腫瘤病理診斷中，有5%-10%的病例單靠常規染色難以作出明確的診斷，而借助免疫組化技術(shù)準確率可高達98%。

三、免疫組化的步驟

   1，切片，烤片60℃，1h；

   2，脫蠟及復水，二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來(lái)水1min，雙氧水1min；

   3，1份30％H2O2加10份蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；

   4，微波修復，將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復兩次；

   5，將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；

   6，封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；

   7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過(guò)夜；

   8，PBS洗滌3次，每次3min；

   9，滴加二抗，37℃，15-30min；

   10，PBS洗滌3次，每次3min；

   11，滴加SABC，37℃， 30min；

   12，PBS洗滌3次，每次5min；

   13，1ml蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；

   14，DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測反應時(shí)間（約5min）；

   15，自來(lái)水沖洗干凈，過(guò)蒸餾水；

   16，蘇木素復染2min，自來(lái)水沖洗；

   17，脫水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

   18，樹(shù)膠封片，鏡檢。

四、免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題及分析

   1、 石蠟切片在染色過(guò)程中出現脫片現象

   1）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

   2）用高溫修復時(shí)，溫度驟冷也可能引起。

   2、邊緣效應

   切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應距組織邊緣3-4mm。

   3、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

   1）非特異性組分與抗體結合，這需要通過(guò)延長(cháng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當增加濃度來(lái)加強封閉效果；

   2）DAB孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或濃度過(guò)高；

   3）PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著(zhù)色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

   4）標本染色過(guò)程中經(jīng)常出現干片，這容易增強非特異性著(zhù)色。

   4、免疫組化染色呈陰性結果

   1）血清封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)；

   2）DAB孵育時(shí)間過(guò)短；

   3）細胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內參與反應；

   4）開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。

   5、背景

   1）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短；

   2）適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長(cháng)浸洗時(shí)間等。