紅色熒光蛋白（red florescence protein，RFP）是細胞研究的常用蛋白標記，是細胞生物學(xué)示蹤研究中的重要標記物，熒光顯微鏡下可被直接觀(guān)察，因此被廣泛用于腫瘤的生長(cháng)、浸潤及血管發(fā)生等追蹤性研究［。質(zhì)粒轉染和病毒轉染是將RFP 轉染到細胞內的常用方法。慢病毒作為一種較新的病毒載體，具有轉染能力強、毒性小、目的基因表達穩定等優(yōu)點(diǎn)。

   通過(guò)含有紅色熒光蛋白基因的慢病毒（Lentivirus）轉染人腦膠質(zhì)瘤干細胞，以探討慢病毒載體介導RFP 基因轉染標記人腦膠質(zhì)瘤干細胞的轉染有效性，為膠質(zhì)瘤干細胞的實(shí)驗研究和示蹤，提供一種有效的病毒轉染方法，為膠質(zhì)瘤干細胞的研究提供基礎。

   1 材料與方法

   1.1 實(shí)驗材料和儀器

   人腦膠質(zhì)瘤干細胞、紅色熒光蛋白基因的慢病毒（RFP-Lentivirus）；CD133，Nestin 兔抗人，FITC、Cy3 免疫熒光試劑盒；DMEM/F-12，N2 添加劑，BFGF，EGF 因子；熒光顯微鏡，倒置顯微鏡；CO2 培養箱。

   1.2 方法

  （1）腦膠質(zhì)瘤干細胞的培養與傳代，鑒定

   將人腦膠質(zhì)瘤干細胞SU2 反復吹打成單細胞懸液，接種于無(wú)血清干細胞培養基（含DMEM/F12，EGF 20ng/ml，bFGF 20ng/ml，1/100N2）培養瓶中，置于37℃，5%CO2 培養箱。每天觀(guān)察細胞生長(cháng)狀態(tài)，于顯微鏡下觀(guān)察、攝片，并連續培養傳代。然后取生長(cháng)良好的未轉染RFP 的懸浮球體行CD133、Nestin 免疫熒光染色。

  （2）慢病毒轉染膠質(zhì)瘤干細胞

   將球狀干細胞用0.02% 胰酶消化后反復吹打成單細胞懸液，稀釋膠質(zhì)瘤干細胞計數1000~100000 個(gè)轉移至24 孔板，每孔設2~3 個(gè)復孔。每孔加400μl 培養基，待細胞生長(cháng)良好、細胞密度達30%~40%，每孔加1~2μl 帶紅色熒光病毒顆粒，輕輕混勻，病毒量不宜過(guò)高。8h 左右離心后棄培養基，換上新鮮培養基。2~3d 后在熒光顯微鏡下觀(guān)察紅色熒光表達情況。

  （3）轉染率

   檢測 將生長(cháng)良好的轉染后的膠質(zhì)瘤干細胞連續多次體外傳代，用胰酶制成單細胞懸液，PBS 反復沖洗，在200 倍熒光顯微鏡［激發(fā)波長(cháng)488nm、發(fā)射波長(cháng)（530±15）nm］下進(jìn)行RFP 陽(yáng)性細胞計數。每個(gè)樣本計數10 個(gè)視野，每個(gè)視野計數100 個(gè)細胞。計算RFP 陽(yáng)性細胞的轉染率。轉染率=RFP 陽(yáng)性細胞數/ 細胞總數×100％。

  （4）生長(cháng)曲線(xiàn)繪制

   將球狀SU2 和RFP-SU2 經(jīng)0.02 ％胰酶消化并離心后加人DMEM/F12 培養液制成單細胞懸液并行細胞計數。將兩組細胞分別分成9孔，每孔設置3 個(gè)副孔，細胞以5×103 ／孔接種于96 孔板，置于37℃、5％ CO2 條件下培養。分別于培養的24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d 進(jìn)行檢測，每孔加入5mg/ml MTT 溶液20μl，37℃、5％CO2 的條件下孵育4h 后終止培養。小心吸凈上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）100μl，平板床振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定細胞的吸光度（OD）值，所用實(shí)驗波長(cháng)為490nm。將RFPSU2組與未進(jìn)行RFP 轉染的單純SU2 生長(cháng)對照組于轉染后每日按上述步驟進(jìn)行MTT 檢測。以時(shí)間為橫軸，OD 值為縱軸, 繪制兩組細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)。

  （5）慢病毒轉染后腦膠質(zhì)瘤干細胞的免疫熒光染色

   取經(jīng)多次體外連續傳代培養慢病毒轉染后的腦膠質(zhì)瘤干細胞（RFP-SU2）行CD133、Nestin 免疫熒光染色。具體步驟：將RFP-SU2 種植到經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的玻片上，56℃溫箱中烘干，PBS 洗3 次，4% 多聚甲醛室溫固定20min，PBS 洗2 次，0.1% Triton-X100 孵育10min，PBS 洗2 次；1%BSA封閉，室溫孵育1h，PBS 洗2 次；分別加入適量以封閉液稀釋的第一抗體CD133、Nestin，4℃孵育過(guò)夜；PBS 洗3 次，加入FITC（兩種抗體只能加FITC，因為轉染后的干細胞表達紅色熒光蛋白）耦聯(lián)的二抗，室溫避光孵育2h ；PBS 洗3 次，以50%、70%、95% 和100% 四個(gè)濃度梯度的乙醇梯度脫水，甘油封片，取出蓋玻片，覆蓋在載玻片上，自然晾干，于熒光顯微鏡下觀(guān)察，攝片。