亚洲国产一级毛片视频-无码人妻久久一区二区三区-国产一级黄色毛片视频-精品中文字幕久久久久久-亚洲精品影院综合在线观看

新浪微博
微信互動(dòng)

慢病毒載體介導紅色熒光蛋白基因轉染人腦膠質(zhì)瘤干細胞

   紅色熒光蛋白(red florescence protein,RFP)是細胞研究的常用蛋白標記,是細胞生物學(xué)示蹤研究中的重要標記物,熒光顯微鏡下可被直接觀(guān)察,因此被廣泛用于腫瘤的生長(cháng)、浸潤及血管發(fā)生等追蹤性研究[。質(zhì)粒轉染和病毒轉染是將RFP 轉染到細胞內的常用方法。慢病毒作為一種較新的病毒載體,具有轉染能力強、毒性小、目的基因表達穩定等優(yōu)點(diǎn)。

 

   通過(guò)含有紅色熒光蛋白基因的慢病毒(Lentivirus)轉染人腦膠質(zhì)瘤干細胞,以探討慢病毒載體介導RFP 基因轉染標記人腦膠質(zhì)瘤干細胞的轉染有效性,為膠質(zhì)瘤干細胞的實(shí)驗研究和示蹤,提供一種有效的病毒轉染方法,為膠質(zhì)瘤干細胞的研究提供基礎。

 

   1 材料與方法

 

   1.1 實(shí)驗材料和儀器

 

   人腦膠質(zhì)瘤干細胞、紅色熒光蛋白基因的慢病毒(RFP-Lentivirus);CD133,Nestin 兔抗人,FITC、Cy3 免疫熒光試劑盒;DMEM/F-12,N2 添加劑,BFGF,EGF 因子;熒光顯微鏡,倒置顯微鏡;CO2 培養箱。

 

   1.2 方法

 

  (1)腦膠質(zhì)瘤干細胞的培養與傳代,鑒定

 

   將人腦膠質(zhì)瘤干細胞SU2 反復吹打成單細胞懸液,接種于無(wú)血清干細胞培養基(含DMEM/F12,EGF 20ng/ml,bFGF 20ng/ml,1/100N2)培養瓶中,置于37℃,5%CO2 培養箱。每天觀(guān)察細胞生長(cháng)狀態(tài),于顯微鏡下觀(guān)察、攝片,并連續培養傳代。然后取生長(cháng)良好的未轉染RFP 的懸浮球體行CD133、Nestin 免疫熒光染色。

 

  (2)慢病毒轉染膠質(zhì)瘤干細胞

 

   將球狀干細胞用0.02% 胰酶消化后反復吹打成單細胞懸液,稀釋膠質(zhì)瘤干細胞計數1000~100000 個(gè)轉移至24 孔板,每孔設2~3 個(gè)復孔。每孔加400μl 培養基,待細胞生長(cháng)良好、細胞密度達30%~40%,每孔加1~2μl 帶紅色熒光病毒顆粒,輕輕混勻,病毒量不宜過(guò)高。8h 左右離心后棄培養基,換上新鮮培養基。2~3d 后在熒光顯微鏡下觀(guān)察紅色熒光表達情況。

 

  (3)轉染率

 

   檢測 將生長(cháng)良好的轉染后的膠質(zhì)瘤干細胞連續多次體外傳代,用胰酶制成單細胞懸液,PBS 反復沖洗,在200 倍熒光顯微鏡[激發(fā)波長(cháng)488nm、發(fā)射波長(cháng)(530±15nm]下進(jìn)行RFP 陽(yáng)性細胞計數。每個(gè)樣本計數10 個(gè)視野,每個(gè)視野計數100 個(gè)細胞。計算RFP 陽(yáng)性細胞的轉染率。轉染率=RFP 陽(yáng)性細胞數/ 細胞總數×100%。

 

  (4)生長(cháng)曲線(xiàn)繪制

 

   將球狀SU2 RFP-SU2 經(jīng)0.02 %胰酶消化并離心后加人DMEM/F12 培養液制成單細胞懸液并行細胞計數。將兩組細胞分別分成9孔,每孔設置3 個(gè)副孔,細胞以5×103 /孔接種于96 孔板,置于37℃、5 CO2 條件下培養。分別于培養的24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d 進(jìn)行檢測,每孔加入5mg/ml MTT 溶液20μl,37℃、5CO2 的條件下孵育4h 后終止培養。小心吸凈上清液,加入二甲基亞砜(DMSO100μl,平板床振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定細胞的吸光度(OD)值,所用實(shí)驗波長(cháng)為490nm。將RFPSU2組與未進(jìn)行RFP 轉染的單純SU2 生長(cháng)對照組于轉染后每日按上述步驟進(jìn)行MTT 檢測。以時(shí)間為橫軸,OD 值為縱軸, 繪制兩組細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)。

 

  (5)慢病毒轉染后腦膠質(zhì)瘤干細胞的免疫熒光染色

 

   取經(jīng)多次體外連續傳代培養慢病毒轉染后的腦膠質(zhì)瘤干細胞(RFP-SU2)行CD133、Nestin 免疫熒光染色。具體步驟:將RFP-SU2 種植到經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的玻片上,56℃溫箱中烘干,PBS 3 次,4% 多聚甲醛室溫固定20min,PBS 2 次,0.1% Triton-X100 孵育10min,PBS 2 次;1%BSA封閉,室溫孵育1h,PBS 2 次;分別加入適量以封閉液稀釋的第一抗體CD133、Nestin,4℃孵育過(guò)夜;PBS 3 次,加入FITC(兩種抗體只能加FITC,因為轉染后的干細胞表達紅色熒光蛋白)耦聯(lián)的二抗,室溫避光孵育2h ;PBS 3 次,以50%、70%、95% 100% 四個(gè)濃度梯度的乙醇梯度脫水,甘油封片,取出蓋玻片,覆蓋在載玻片上,自然晾干,于熒光顯微鏡下觀(guān)察,攝片。

 

上一篇:核基質(zhì)結合區修飾的附著(zhù)體載體介導的EGFP基因體外表達
下一篇:免疫組化技術(shù)服務(wù)
分享到: