巨噬細胞的分離與純化實(shí)驗方法
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發(fā)布時(shí)間：2016-11-24
一)從小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分離巨噬細胞
1.取6周左右的小鼠(或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔)，剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml(豚鼠20ml，家兔200ml)無(wú)菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4%淀粉肉湯。3～4天以后收集腹腔細胞。
2.如要收集腹腔靜置巨噬細胞，不注射刺激物，直接從這一步開(kāi)始。放血處死動(dòng)物，以減少腹腔中的紅細胞。消毒腹部，沿腹中線(xiàn)注入3～4ml(豚鼠20～40ml，家兔50～70ml)冰中預冷的無(wú)菌PBS -H(含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS)。輕輕按摩腹部5分鐘。
3.以下均無(wú)菌操作。剪開(kāi)腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預冷PBS -H沖洗腹腔2～3次。合并滲出液于離心管中，4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。
4.用預冷的RPMI-1640 培養液洗滌細胞3次，每次4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。用預冷的適量RPMI-1640培養液懸浮細胞，臺盼藍染色計數細胞并決定細胞活力。
二)家兔肺泡巨噬細胞的分離和純化
1.取2～3公斤重的家兔，耳緣靜脈注射10ml空氣處死動(dòng)物或注射2ml(含130mg)戊巴比妥麻醉動(dòng)物。仰臥固定，消毒胸部，剪開(kāi)胸壁。以下過(guò)程注意無(wú)菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結締組織。用無(wú)菌紗布小心擦凈肺表面，稱(chēng)重。
2.分離肺泡巨噬細胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射40ml無(wú)菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進(jìn)入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用40ml無(wú)菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3.分離肺組織中的巨噬細胞：取出肺泡巨噬細胞后，剪去氣管，將肺組織放在有冷RPMI-1640 培養液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿(mǎn)冷RPMI-1640培養液的20ml注射器接23號針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹(shù)全部分離。使肺組織通過(guò)200目的鋼絲網(wǎng)，分離單個(gè)細胞。
4.以下過(guò)程均在4℃中進(jìn)行。分別處理肺泡巨噬細胞和肺組織中的巨噬細胞：離心200×g 10分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細胞，加入10ml低滲液(20mmol/L Tris, 0.75%氯化銨，pH7.4)，37℃處理3～5分鐘，溶解紅細胞。紅細胞通常分別占肺泡巨噬細胞和組織巨噬細胞的1%和10%。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細胞分離液上分離巨噬細胞。
5.離心200×g 10分鐘，去上清液。用RPMI-1640 培養液洗滌細胞一次。將細胞懸液加在淋巴細胞分離液(比重1.077)上，離心400×g 20分鐘，收集交界面的巨噬細胞。棄去沉淀的死細胞和紅細胞。
6.用RPMI-1640培養液洗滌巨噬細胞2次。臺盼藍染色檢測細胞活力和細胞數，將細胞配成所需濃度。此時(shí)巨噬細胞活力可達90%以上，巨噬細胞占全部細胞的90%以上。
