一、材料和試劑
1. Hairpin-pLKO.1vector(OpenBiosystems)
2. Packagingvectors:第二代包裝質(zhì)粒包含gag,pol,和rev基因(pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2)和包被質(zhì)粒(pMD2.G)(Addgene)
3. 脂質(zhì)體2000(Invitrogen)
4.OptiMEM無(wú)血清培養基(Invitrogen)
5. 293T包裝細胞(ATCC)
6. DMEM(Invitrogen)
7. 胎牛血清(Invitrogen)
8. 青/鏈霉素(Invitrogen)
9. 6 cm 細胞培養皿(Fisher)
10. 45 um 過(guò)濾器(Fisher)
二、儀器
1. 細胞培養箱
2. 離心機
三、實(shí)驗步驟
1. 6 cm 細胞培養皿中種植293T細胞,細胞密度為1.3~1.5×105,每孔體積6 ml。
2. 孵育細胞24 h(37℃,5%CO2),或者孵育至第二天下午。約24 h 后,細胞融合度應該達到了70%。
3. 轉染包裝細胞:
(1)準備含有3種轉染質(zhì)粒的混合物
900 ng 包裝質(zhì)粒
100 ng 包被質(zhì)粒
1 ug pLKO.1質(zhì)粒
10~30 ul OptiMEM培養基
(2)用OptiMEM稀釋脂質(zhì)體2000:10 ul 脂質(zhì)體+90 ul OptiMEM。逐滴滴加脂質(zhì)體試劑,通過(guò)顛倒旋轉或者輕彈管子來(lái)混勻,(不能用移液器或者渦旋來(lái)混勻),室溫下孵育5分鐘。
(3)向稀釋的脂質(zhì)體中逐滴滴加上述3種質(zhì)?;旌衔?,顛倒旋轉或者輕彈管子混勻。
(4)室溫下孵育轉染混合物20~30分鐘。
(5)小心將轉染混合物移入包裝細胞的培養液中。包裝細胞對外源干擾非常敏感-小心不要讓細胞從板上脫落。每板需要轉染混合物的總體積為100~125 μL。
4. 孵育細胞18 h(37℃,5%CO2),或者直到第二天早上。
5. 更換培養液以去除轉染試劑,為了進(jìn)行病毒收獲更替為6 mL 的收獲培養液。
6. 孵育細胞24 h(37℃,5%CO2)。
7. 在轉染約40 h 后收集含有慢病毒的培養液。將培養液移入儲存管中。替換為6 mL 的收獲培養液。
8. 每12~24 h 重復上述病毒收獲過(guò)程,并且替換為6 mL 的收獲培養液。病毒滴度在收獲過(guò)程中會(huì )逐漸的減弱;通??偣彩占?~3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒。最后一次收獲之后,丟棄包裝細胞。病毒收獲物可以按需要進(jìn)行合并。
9. 1250 rpm 的轉速旋轉包含病毒的培養液5分鐘,使得在收獲過(guò)程中所收集的包裝細胞變成球狀。將上清液通過(guò)45 um 過(guò)濾器,然后移入無(wú)菌儲存管中。
10. 病毒在4℃可以保存時(shí)間較短(數小時(shí)到數天),但是在-20℃或在-80℃可以?xún)龃孑^長(cháng)時(shí)間。為了減少凍結/解凍的次數,在長(cháng)期儲存之前,需將大量的病毒產(chǎn)品分裝入小的儲存管中。
(本文轉載丁香通)