一、材料和試劑

      1.  Hairpin-pLKO.1vector（OpenBiosystems）

      2.  Packagingvectors:第二代包裝質(zhì)粒包含gag,pol,和rev基因（pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2）和包被質(zhì)粒（pMD2.G）（Addgene）

      3.  脂質(zhì)體2000（Invitrogen）

      4.OptiMEM無(wú)血清培養基（Invitrogen）

      5.  293T包裝細胞（ATCC）

      6.  DMEM（Invitrogen）

      7.  胎牛血清（Invitrogen）

      8.  青/鏈霉素（Invitrogen）

      9.  6 cm 細胞培養皿（Fisher）

     10.  45 um 過(guò)濾器（Fisher）

二、儀器

      1.  細胞培養箱

      2.  離心機

三、實(shí)驗步驟

      1.  6 cm 細胞培養皿中種植293T細胞，細胞密度為1.3~1.5×105，每孔體積6 ml。

      2.  孵育細胞24 h（37℃，5%CO2），或者孵育至第二天下午。約24 h 后，細胞融合度應該達到了70%。

      3.  轉染包裝細胞:

      （1）準備含有3種轉染質(zhì)粒的混合物

      900 ng 包裝質(zhì)粒

      100 ng 包被質(zhì)粒

      1 ug pLKO.1質(zhì)粒

      10~30 ul OptiMEM培養基

     （2）用OptiMEM稀釋脂質(zhì)體2000：10 ul 脂質(zhì)體+90 ul OptiMEM。逐滴滴加脂質(zhì)體試劑，通過(guò)顛倒旋轉或者輕彈管子來(lái)混勻，（不能用移液器或者渦旋來(lái)混勻），室溫下孵育5分鐘。

     （3）向稀釋的脂質(zhì)體中逐滴滴加上述3種質(zhì)?；旌衔?，顛倒旋轉或者輕彈管子混勻。

     （4）室溫下孵育轉染混合物20~30分鐘。

     （5）小心將轉染混合物移入包裝細胞的培養液中。包裝細胞對外源干擾非常敏感-小心不要讓細胞從板上脫落。每板需要轉染混合物的總體積為100~125 μL。

      4.  孵育細胞18 h（37℃，5%CO2），或者直到第二天早上。

      5.  更換培養液以去除轉染試劑，為了進(jìn)行病毒收獲更替為6 mL 的收獲培養液。

      6.  孵育細胞24 h（37℃，5%CO2）。

      7.  在轉染約40 h 后收集含有慢病毒的培養液。將培養液移入儲存管中。替換為6 mL 的收獲培養液。

      8.  每12~24 h 重復上述病毒收獲過(guò)程，并且替換為6 mL 的收獲培養液。病毒滴度在收獲過(guò)程中會(huì )逐漸的減弱；通?？偣彩占?~3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒。最后一次收獲之后,丟棄包裝細胞。病毒收獲物可以按需要進(jìn)行合并。

      9.  1250 rpm 的轉速旋轉包含病毒的培養液5分鐘，使得在收獲過(guò)程中所收集的包裝細胞變成球狀。將上清液通過(guò)45 um 過(guò)濾器，然后移入無(wú)菌儲存管中。

      10.  病毒在4℃可以保存時(shí)間較短（數小時(shí)到數天），但是在-20℃或在-80℃可以?xún)龃孑^長(cháng)時(shí)間。為了減少凍結/解凍的次數，在長(cháng)期儲存之前，需將大量的病毒產(chǎn)品分裝入小的儲存管中。

      （本文轉載丁香通）