一、原理

 

      1、E .coli 表達系統 

      E .coli 是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入E .coli 菌株以后，通過(guò)溫度的控制，誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質(zhì)，將表達樣品進(jìn)行SDS-PAGE 以檢測表達蛋白質(zhì)。

      2、外源基因的誘導表達 

      提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(cháng)與外源基因的表達分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負荷。常用的有溫度誘導和藥物誘導。本實(shí)驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導外源基因表達。

      不同的表達質(zhì)粒表達方法并不完全相同，因啟動(dòng)子不同，誘導表達要根據具體情況而定。 

二、材料 

      1、誘導表達材料 

      (1 )LB （Luria—Bertani）)培養基 

      酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10g 

      NaCl10g 瓊脂 (Agar)1-2% 

      蒸餾水 (Distilled water)1000ml pH 7.0 

      適用范圍：大腸桿菌 

      (2 )IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸餾水中，0 .22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝成1 ml /份，－20 ℃ 保存。 

      (3 )l× 凝膠電泳加樣緩沖液： 

      50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 ) 

      50 mmol / L DTT 

      2 % SDS （電泳級） 

      0.1 % 溴酚藍 

      10 % 甘油 

      2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料 

      酶溶法 

    （1）裂解緩沖液：

 
      50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 ) 

      1 mmol / L EDTA 

      100 mmol / LNaCI 

    （2）50 mmol / L

 

    （3）10 mg / ml 溶菌酶。 

    （4）脫氧膽酸。 

    （5）1 mg / ml DNase I。 

 
      超聲破碎法 

 
      (1 )TE 緩沖液。

 
      (2 )2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：

 
      100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 ) 

      100 mmol / L DTT 

      4 %SDS 

      0.2 % 溴酚藍 

      20 % 甘油 

三、實(shí)驗方案

      1、外源基因的誘導表達

      (1 ）用適當的限制性?xún)惹泻怂崦赶d體DNA 和目的基因。

      (2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到相應的宿主菌。

      (3 ）篩選出含重組子的轉化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性?xún)惹泻怂崦笀D譜，DNA 序列測定，確定無(wú)誤后進(jìn)行下一步。

      (4 ）如果表達載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子，則在30 -32 ℃ 培養數小時(shí)，使培養液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續培養3 -5h ；如果表達載體的原核啟動(dòng)子為tac 等，則37 ℃培養細菌數小時(shí)達到對數生長(cháng)期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續培養3 -5h 。

      (5 ）取上述培養液1 ml ,1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。

      2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化

      細菌的裂解

      常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用，后三種方法在實(shí)驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗步驟。

     （1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類(lèi)有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著(zhù)。主要步驟為：

      ① 4 ℃ ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導表達的細菌培養液（100 ml ）。棄上清，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液，懸浮沉淀。

      ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）。

      超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強度聲能輸入下可以進(jìn)行細胞破碎，在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液體量損失較少，同時(shí)還可對染色體DNA 進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。

      ① 收集1 L 誘導表達的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 離心，15 min ；棄上清，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液。

      ② 按超聲處理儀廠(chǎng)家提供的功能參數進(jìn)行破菌；10 000g 離心，15min ，分別收集上清液和沉淀。

      ③ 分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS -PAGE 。

      注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細胞濃度、菌種類(lèi)型等因素有關(guān)，應根據具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。
    

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