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電穿孔轉化感受態(tài)E.coli TG1細胞的制備

材料和試劑

 

      1. 恒溫旋轉式搖床

 

      2. 三角燒瓶(容量為1或2L)

 

      3. 50ml滅菌離心管

 

      4. 低溫高速離心機

 

      5. SB培養基

 

      細菌培養用胰化蛋白胨     20g


      細菌培養用酵母提取物      5g


      NaCl                     0.5g


      去離子水                 950ml

 

      250mmol/L KCl溶液        10ml

 

       以5N的NaOH調節溶液的pH值至7.0,加去離子水至1L,高壓蒸氣滅菌。

 

      6. 20%葡萄糖溶液

 

      7. 1mol/L MgCl2溶液

 

      8. 10%甘油

 

操作步驟

 

      1. 從新鮮的LB平板培養物中挑選一個(gè)TG1克隆,接種于10m1 SB培養基中。

 

      2. 37℃搖床培養過(guò)夜。

 

      3. 取2.5ml培養物轉接于0.5L SB中,另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。

 

      4. 37℃培養直到OD600=0.7~0.8。

 

      5. 將培養物置于冰浴15min,然后4000r/min于4℃離心20min,棄上清。

 

      6. 將菌體重懸于1/2體積的預冷10%甘油中,4000r/min于4℃離心20min,棄上清。

 

      7. 重復第(6)步驟。

 

      8. 將菌體重懸于15ml 10%甘油,并轉移至一支50ml的離心管中。3500r/min于4℃離心15min。小心地去掉上清,得到4~5ml細菌。迅速地將其吹打重懸;


      9. 分裝成200μl或40μl 的小份,操作應在乙醇/干冰浴中進(jìn)行。貯存于-70℃。

 

      10. 用pUC19質(zhì)粒測試制備感受態(tài)細菌的轉化效率,應達到109cfu/μg DNA。


      (本文轉載網(wǎng)絡(luò ))

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