1．目的

 

      學(xué)會(huì )用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉化成功的克隆菌。

 

2．原理

 

      利用轉化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。

 

3．器材

 

      旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無(wú)菌牙簽，搖菌管。

4．試劑

 

      LB培養基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性?xún)惹颐讣捌渚彌_液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-Cl pH8.0）。

5．實(shí)驗準備

 

      無(wú)菌dd water，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/mL氨芐青霉素。

6．操作步驟

 

      方法一：酶切鑒定

 

    （1）在超凈工作臺中取3支無(wú)菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號筆寫(xiě)好編號。

 

    （2）在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過(guò)，鑷取一支無(wú)菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉化的平板培養基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素）的搖菌管中。用此法隨機取3個(gè)白色菌落，分別裝入3個(gè)搖菌管中。

    （3）37℃搖菌過(guò)夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

 

    （4）將提取到的3管質(zhì)粒樣品與空質(zhì)粒同時(shí)電泳，根據分子量判斷和選區有插入片段的質(zhì)粒，然后可用酶切、與目的片段一同電泳來(lái)鑒定其上的外源插入片斷大小是否與預期相符。

    （5）將經(jīng)過(guò)鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號找到冰箱中原菌液。根據需要進(jìn)行放大培養提取其質(zhì)?；蜻M(jìn)行誘導表達，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后-80℃保存。

    （6）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗報告。

 

方法二：快速PCR篩選法

 

    （1）在轉化的平板培養基上隨機選取3個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標記編號。

 

    （2）在0.2ml PCR 微量離心管中配制25μl反應體系。

 

       dd water                      16μl

 

       10×PCR buffer（不含MgCl2）  2.5μl

 

       25mM MgCl2                           1.5μl

 

       2.5mmol/L dNTP               2μl（每種dNTP終濃度0.2mM）

 

       10μmol/L Primer1              1μl（12.5-25pmoles）

 

       10μmol/L primer2              1μl（12.5-25pmoles）

 

       Taq酶                       0.5μl（1.5u）

 

       總體積                       25μl

 

       模板質(zhì)粒： 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗

 

      （1）根據廠(chǎng)商的操作手冊設置PCR儀的循環(huán)程序（本實(shí)驗室已經(jīng)設置為WZ）：

 

       ① 94℃ 5min

 

       ② 94℃ 1min

 

       ③ 60℃ 1min

 

       ④ 72℃ 1min50s

 

       ⑤ goto② 29 times

 

       ⑥ 72℃  10min

 

     （2）PCR結束后，取10μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時(shí)比對）。觀(guān)察膠上是否有預計的主要產(chǎn)物帶。

 

     （3）按照編號找到培養皿中的原菌斑。根據需要進(jìn)行放大培養提取其質(zhì)粒

 

     （4）提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對比電泳，用酶切以進(jìn)一步確認。

      （本文轉載丁香通）