原代培養從人腎皮質(zhì)外層切除的組織塊為分離表達許多近段小管功能特征的細胞提 供了方法。經(jīng)逐級消化分離和粗略過(guò)濾獲得單個(gè)細胞和較小的細胞團，以高密度接種這些細胞時(shí)得到不均一的上皮細胞。能夠獲得大量細胞，有利于用多個(gè)器皿進(jìn)行原代培養或擴增細胞和凍存細胞。使用這種方法的經(jīng)驗表明，原代細胞和傳代細胞的功能特征可反映不同供體腎的功能。

實(shí)驗方法原理

     將自皮質(zhì)切除的組織快切成碎塊，沖洗后放入膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液，搖晃消化。定時(shí)用吸管研磨組織塊，然后手機分離的細胞。用一定孔徑大小的濾網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，除去未消化的組織塊。然后，洗細胞，清除消化酶。用添加血清的培養液混懸細胞，將細胞接種于塑料培養器皿。
 
試劑、試劑盒

     DMEM   FBS   膠原蛋白酶   胰蛋白酶

儀器、耗材

     手術(shù)刀   組織鑷
 

實(shí)驗步驟

一、材料

 無(wú)菌

      1. 基礎培養液：DMEM 和 F12 混合液 50：50
 
      2. FBS（Sterile Systems, Hyclone)
 
      3. 完全培養液：DMEM 和 F12 混合液，添加 10%FBS
 
      4. BSS
 
      5. 0.1% 膠原蛋白酶（IV 型，Worthington）和 0.1% 胰蛋白酶（1：250，Sigma）混合液，用 0.15mol/L NaCl 配制
 
      6. 0.5 mg/ml DNase，用生理鹽水配制
 
      7. 胰蛋白酶和 EDTA 混合液：用 0.1% 胰蛋白酶（1：250）和 1 mm/L EDTA(培養基，Sigma）配制
 
      8. 手術(shù)刀和組織鑷
 
      9. 孔徑為 160um 的 Nitex 濾網(wǎng)（Tetko）
 
      10. 培養皿和培養瓶
 
      11. 50 ml 試管

 非滅菌

       1. 有軌振蕩器（Bellco）

 二、操作步驟

 消化組織

       1. 按冠狀面將腎切成 5~10 mm 厚的組織片。用冰冷的基礎培養液洗組織片。

       2. 從皮質(zhì)的外層切下組織，然后用十字刀片切成 1~2 mm 小塊。

       3. 將約 5 ml 組織塊放入盛有預熱的 20 ml 膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液的 50 ml 試管。

       4. 輕輕搖晃，孵育組織塊 1 h。

       5. 吸除消化液，然后加入新鮮消化液。

       6. 每隔 20 min 收集細胞懸液，然后加入 20 ml 含有 0.5 mg/ml DNase 的培養基礎液，用 10 ml 吸管輕輕研磨 10 轉。

       7. 用等量的完全培養液稀釋收集的細胞懸液。將稀釋后的細胞懸液置于冰上。

       8. 重復收集步驟 5 次或 5 次以上，直至組織塊被完全分散。

       9. 將收集的細胞懸液混合，分裝如 50 ml 試管，

       10. 離心（100 g，15 min）后，用 45 ml 含 DNase 的完全培養液混懸細胞。

       11. 用孔徑為 160um 的 Nitex 濾網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液。

       12. 這種分離方法既分離到系抱團，又分離到單個(gè)細胞，故細胞計數不可靠。每個(gè) 75 cm2 培養瓶?jì)确?15 ml 細胞懸液，細胞擴增后傳代培養或凍存。