人滑膜細胞原代培養可以：（1）細胞保種；（2）用于相應細胞生理、形態(tài)學(xué)研究；（3）用于相關(guān)疾病研究。

實(shí)驗方法原理

     將人滑膜從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置α-MEM生長(cháng)培養基中培養，使細胞得以生存、生長(cháng)和繁殖。

實(shí)驗材料

     滑膜組織

試劑、試劑盒

     Ⅰ型膠原酶   胎牛血清   生理鹽水   PBS

儀器、耗材

     超凈臺   解剖剪   過(guò)濾網(wǎng)   離心管   記數板   培養瓶

實(shí)驗步驟

一、實(shí)驗材料準備

     1.   滑膜組織：將外科手術(shù)切下的組織在手術(shù)臺上請護士將標本放入低溫生理鹽水中，在手術(shù)完成時(shí)將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗室。

     2.   試劑：4 mg/mlⅠ型膠原酶(α-MEM配制)，培養液(含10%胎牛血清的α-MEM)。

     3.   器械：手術(shù)器械。

二、方法

     1.   將切下的組織在手術(shù)臺上請護士將標本放入低溫生理鹽水中(靜止)，在手術(shù)完成時(shí)將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗室。

     2.  在超凈臺中將標本放入培養皿中，加入α-MEM洗滌。

     3.  獲得組織切開(kāi)，仔細辨認于關(guān)節反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關(guān)節軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化)，仔細剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次(以去除紅細胞)，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎。

     4.   用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動(dòng)混勻數次)。

     5.   30分鐘后收集第一管細胞：細胞懸液經(jīng)70 μm細胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000轉離心6分鐘，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過(guò)濾網(wǎng)的組織，繼續用于消化。

     6.   離心管底細胞用α-MEM離心洗滌2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉，離心6分鐘，最后一次用記數板觀(guān)察到有細胞。細胞最終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養瓶中培養。

     7.  60鐘后收集第二管細胞：細胞懸液經(jīng)70 μm細胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000 rpm離心6分鐘；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘，最后一次用記數板觀(guān)察細胞并計數。細胞最終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接種到培養瓶中培養。

     8.   必要時(shí)可做第三管細胞收集；并立即作原代滑膜細胞培養。

     9.  每2-3天換液一次。

注意事項

     1.   雖然國內外文獻有組織塊培養法獲得滑膜細胞，但作者試驗過(guò)，沒(méi)有獲得滑膜細胞，可能方法沒(méi)掌握好或實(shí)驗條件不同；

     2.  我探索過(guò)用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02% EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化細胞或合用，只有單用collagenaseⅠ有用、最好；

     3.   機械法很難獲得細胞；

     4.  全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用國產(chǎn)即可；

     5.  必須用Ca2+-free的PBS。