[目的與原理]  

     應用氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）法，測定不同魚(yú)類(lèi)血紅蛋白含量。 

     血紅蛋白(Hb)被高鐵氰化鉀[K 3 Fe(CN) 6 ]氧化為高鐵血紅蛋白（Hi），Hi與氰離子結合成氰化高鐵血紅蛋白（HiCN），它在540nm有一吸收峰，通過(guò)測定其光密度而得血紅蛋白含量。

 

     [實(shí)驗對象] 

     鯉、鯽或草魚(yú)。

 

     [ 試劑 與器材] 

     分光光度計，試管若干，移液管（5ml），吸血管（20u1），注射器，凹瓷盤(pán)，試管，試管架，蒸餾水，75%酒精，棉球，紗布，抗凝劑（1%肝素鈉溶液或10%草酸鉀溶液）。
氰化高鐵血紅蛋白稀釋 試劑 ：稱(chēng)取高鐵氰化鉀[K 3 Fe(CN) 6 ]200mg、氰化鉀（KCN）50mg、無(wú)水磷酸二氫鉀140mg，Triton X-100 1.0ml，用蒸餾水溶解并稀釋至1L。此試劑應呈透明、淡黃色，pH在7.0～7.4之間，以蒸餾水作空白，在540nm比色，讀數也是0。此溶液應放置棕色試劑瓶中，塞緊后保存于冰箱中（但不宜凍結），至少可穩定數月。如發(fā)現試劑變綠、渾濁則不能使用。

 

     [實(shí)驗步驟] 

    1、在一 試管 中準確加入HiCN稀釋試劑5.0ml，作為測定管。 

    2、用血紅蛋白吸管準確吸取全血20u1，擦去管端血跡，置于試劑中，沖洗3次，混和。 

    3、將混合液放置3分鐘以后，倒入光徑1cm比色皿，用分光光度計在540nm進(jìn)行比色。以 蒸餾 水或HiCN稀釋試劑作空白管，校正光密度到0點(diǎn)，讀取測定管光密度讀數。 

    4、計算： 

     血紅蛋白（g/L）= 測定管光密度×（64458/44000）×251 = 測定管光密度 × 367.7 式中： 

   （1）64458 是目前國際公認的血紅蛋白分子量。 

   （2）44000 是國際血液學(xué)標準化委員會(huì )公布的血紅蛋白摩爾吸光度。 

   （3）251是稀釋倍數。

 

     [方法評估] 

     HiCN法操作簡(jiǎn)便，試劑單一，除SHb外所有血紅蛋白均可迅速轉化為HiCN，顯色快且穩定，可以根據吸光度直接計算結果，因此被列為國際血紅蛋白測定的參考方法，也是我國推薦的首選方法，但其試劑中氰化鉀為劇毒藥品，須妥善保存、處理。另外，高球蛋白血癥和白細胞明顯增高的標本可導致反應液渾濁而影響結果。

 

     [應用意義] 

     同改良沙利氏法。

 

     [注意事項] 

     1、血紅蛋白測定方法很多。但無(wú)論采用何種方法，都必須以HiCN法為標準，繪制標準曲線(xiàn)。 

     2、HiCN稀釋液不能貯存在塑料瓶中，否則會(huì )使CNˉ丟失，測定結果偏低。HiCN稀釋液應貯存在棕色有塞玻璃瓶中，4℃冰箱保存一般可用數月，但不能在0℃以下保存，因為結冰可引起高鐵氰化鉀還原，使溶液褪色失效。 

     3、氰化鉀是劇毒品，配制稀釋液時(shí)要按劇毒品管理程序操作。配制好的HiCN稀釋液中因氰化鉀含量低，又有高鐵氰化鉀存在，毒性不是很大。若進(jìn)入體內，高鐵氰化鉀氧化血紅蛋白，生成高鐵血紅蛋白。后者結合CNˉ，起到一定的解毒作用，但仍應妥善保管。測定后的廢液不能與酸性溶液混合，因為氰化鉀遇酸可產(chǎn)生劇毒的氰氫酸氣體。為防止氰化鉀污染環(huán)境，比色測定后的廢液集中于廣口瓶中。應注意廢液處理，可用除毒液除毒。 

     除毒方法為：取硫酸亞鐵（FeSO 4 ·7H 2 O）二份加NaOH一份，在 研缽 中研細，配成100g/L的懸液。每1000ml廢液加上述除毒液5ml，放置3小時(shí)，不時(shí)攪拌，使劇毒的氰化鉀成為無(wú)毒的亞鐵氰化鉀。