DNA分子的限制性?xún)惹忻赶僮髁鞒?/h1>

發(fā)布人：admin 瀏覽次數：1149 發(fā)布時(shí)間：2016-10-08

一、限制性?xún)惹忻?對DNA消化的方案 

     1.限制性?xún)惹忻阜磻跍缇?/span>0.5ml離心管中進(jìn)行。 

     2. 20μl體積反應體系如下： 

     DNA 0.2-1 μg 

     10×酶切buffer 2.0 μl 

     限制性?xún)惹忻?1-2 u(單位) 

     加ddH2O 至 20 μl 

     限制性?xún)惹忻缸詈蠹尤?，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時(shí)間溫育，一般為37℃水浴消化3hr。 

     3.用于回收酶切片段時(shí)，反應總體積可達50-200μl，各反應組分需相應增加。

 
     4.多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入;否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。 

     5.酶切結束時(shí)，加入0.5M EDTA (pH 8.0)使終濃度達10mM，以終止反應?；驅⒎磻茉?/span>65℃水浴放置10min以滅活限制性?xún)惹忻富钚浴?nbsp;

     6.如消化反應體積過(guò)大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應后，加入0.6體積的5M乙酸銨(或1/10體積3M NaAc)和2倍體積無(wú)水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中(pH 7.6)。

     7.如要純化消化后的DNA，可用等體積酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。

二、電泳檢測 

     取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當loading buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)?；?/span>/和酶切的空載體(如有)作對照，采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子 從負極向正極移動(dòng)，至合適位置取出置紫外燈下檢測，攝片。

三、注意事項 

     1.濃縮的限制性?xún)惹忻缚稍谑褂们耙?/span>1×限制酶緩沖液稀釋?zhuān)形鹩盟♂屢悦饷缸冃浴?nbsp;

     2.購買(mǎi)的限制性?xún)惹忻付啾４嬗?/span>50%甘油中，于-20℃是穩定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應成分加入后即混勻，再從-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應更換一個(gè)無(wú)菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。

     3.盡量減少反應體積，但要確保酶體積不超過(guò)反應總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。 

     4.通常延長(cháng)時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用。在消化過(guò)程中可取少量反應液進(jìn)行微量凝膠電泳以檢測消化進(jìn)程。 

     5.注意星號酶切活力。

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