螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動(dòng)物細胞中不含內源性螢光素酶，一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報告基因實(shí)驗往往會(huì )受到各種實(shí)驗條件的影響，而雙報告基因則通過(guò)共轉染的“對照”作為內參為試驗提供一基準線(xiàn)，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實(shí)驗的影響，使得數據結果更為可信。Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時(shí)表達螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒(méi)有種源同源性并對應不同的反應底物，故而沒(méi)有交叉干擾。得益于超強的光信號和超高的信噪比，本系統被廣泛用于miRNA靶基因驗證。  

      由于miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區域構建至載體中報告基因luciferase的后面， 通過(guò)比較過(guò)表達或者干擾miRNA后，報告基因表達的改變（監測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用；結合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。  

       實(shí)驗目的:  驗證hsa-mir-21與靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否發(fā)生作用并進(jìn)一步確定hsa-mir-21與靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位點(diǎn)。

實(shí)驗材料 

1.質(zhì)粒與細胞株 
    

      pMIR-對照質(zhì)粒（和元生物）；pMIR-TPM1-WT野生型3‘UTR實(shí)驗質(zhì)粒（和元生物）；pMIR-TPM1-MUT突變型3‘UTR實(shí)驗質(zhì)粒（和元生物）； pRL-CMV（E2261， Promega）；293T細胞株來(lái)源于A(yíng)TCC，細胞培養條件為DMEM+10% FBS+5% CO2。  

2.實(shí)驗試劑 

      lipofectamine 2000（11668-019, invitrogen）; 胎牛血清(FBS)（SV30087.02，Hyclone）； DMEM（12800-017，GIBCO）； 胰酶（Trypsin-EDTA）（11668-500，Invitrogen）； 24孔板（3524，Corning）; miR-X mimics（和元生物）；Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910， Promega）； Opti-MEM（31985-062, invitrogen）。  

3.儀器設備

      熒光顯微鏡（IX71，奧林帕斯）；CO2培養箱（3111，Thermo）；生物安全柜（BSC -Ⅱ-A2，上海凈化）； 低速離心機（TDZ4-WS，上海湘儀）； 血球計數板 （REICHERT， Bright-Line）；  水浴鍋（HWS12，上海一恒）；酶標儀（Infinite M1000，TECAN）  

4. 統計學(xué)處理  GraphPad Prism（Ver5，GraphPad Software） 作圖，并進(jìn)行雙側t檢驗。

4.實(shí)驗步驟  

實(shí)驗共分以下主要步驟：  

1.質(zhì)粒轉染細胞：  

      (1)細胞鋪板：將細胞按70%的匯合度接種到96孔板。 

      (2) 轉染：16小時(shí)后轉染螢光素酶報告基因質(zhì)粒和RNA，每個(gè)樣品設置6個(gè)復孔

       1) 配制DNA和轉染試劑: 96孔板轉染質(zhì)粒時(shí)每孔比例Firefly：Renilla：轉染試劑=0.1μg：0.01μg：0.25μl  

       2)配制RNA和轉染試劑稀釋液，RNA的終濃度為100nM，轉染試 劑每孔0.25μL  

       3)稀釋好的DNA和RNA及轉染試劑，常溫孵育5min  

       4)將稀釋好的DNA和RNA分別和轉染試劑混勻，常溫孵育20min 

       5)每孔棄去50ul培養基，將25μL DNA轉染混合液和25uL RNA轉 染混合液分別添加到每孔細胞樣品中，  

       6) 轉染6小時(shí)后，換新鮮完全培養基 

2.雙報告基因檢測  

      (1)質(zhì)粒共轉染48小時(shí)后，棄去培養基，用100μl 1XPBS洗1遍

      (2)傾斜96孔板，吸干剩余的PBS  

      (3)去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫  

      (4)每孔加50μl稀釋好的 1X PLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂 解  

      (5)白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10μl， 加入100 μl預先混好的LAR II，2s后測數據   

      (6) 每孔添加100μl預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數 據  注意：進(jìn)行Luciferase活性檢測時(shí)，需在避光條件下進(jìn)行。

      （本文轉載丁香園）