最近合成了幾十對引物，，在實(shí)戰中多多少少有些心得，拿出來(lái)給大家分享。我感覺(jué)想把引物合成的比較好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我們還要重點(diǎn)考慮以下因素：

一、GC% GC含量
 
      對于PCR反應來(lái)說(shuō)GC含量在40%-60%，一般50%左右比較合適；而對于測序引物和雜交探針來(lái)說(shuō)GC含量至少應為50%。產(chǎn)物中GC含量最好大于引物中的GC含量。

二、Degeneracy 多義性

      當設計多義引物時(shí)應盡量減少引物多義性，這樣會(huì )帶來(lái)更好的特異性，應盡量避免3末端的多義性，因為這里即使一個(gè)堿基的錯配都能阻止引物延伸。

三、3’ End Stability 3 末端穩定性

      引物穩定性影響它的錯配效率，一條理想的引物應該有一個(gè)穩定性較強的5 末端和相對穩定性較弱的3 末端。如果引物3 穩定性強，有可能在即使5 末端不配對的情況下造成錯配，形成非特異性擴增條帶（secondary bands） 。而3 末端穩定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯配時(shí)，由于3 末端不太穩定引物結合不穩定而難以延伸。

四、GC Clamp GC鉗

      引物與目的位點(diǎn)的有效結合需要有穩定的5 末端。這一段有較強穩定性的5 末端稱(chēng)為GC鉗。它保證引物與模板的穩定結合。選擇有合適穩定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。

五、Secondary Structures 二級結構

      二級結構是引物設計中必須考慮的一個(gè)重要因素。二級結構能顯著(zhù)影響反應中能與模板正確結合的引物數量，發(fā)卡結構的存在能限制引物與目的位點(diǎn)的結合能力，從而降低擴增效率，形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴增中發(fā)揮作用。

（本文轉載丁香園）