一  生物發(fā)光      

       生物發(fā)光（bioluminescence）是指生物體發(fā)光或生物體提取物在實(shí)驗室中發(fā)光的現象。它不依賴(lài)于有機體對光的吸收，而是一種特殊類(lèi)型的化學(xué)發(fā)光，化學(xué)能轉變?yōu)楣饽艿男蕩缀鯙?00%。也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機制是：由細胞合成的化學(xué)物質(zhì)，在一種特殊酶的作用下，使化學(xué)能轉化為光能。 與熒光的區別在于：  熒光：熒光檢測需要激發(fā)光源，發(fā)射光的能量來(lái)源于激發(fā)光，熒光反應為瞬時(shí)反應。 發(fā)光：生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光，發(fā)光反應無(wú)需激發(fā)光源，發(fā)射光的能量來(lái)源于化學(xué)反應，發(fā)光有一定的持續時(shí)間。

二  熒光素酶 

       熒光素酶（Luciferase）是生物體內催化熒光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化發(fā)光的一類(lèi)酶的總稱(chēng),來(lái)自于自然界能夠發(fā)光的生物。  自然界存在的熒光素酶來(lái)自螢火蟲(chóng)、發(fā)光細菌、發(fā)光海星、發(fā)光節蟲(chóng)、發(fā)光魚(yú)、發(fā)光甲蟲(chóng)等。細菌熒光素酶對熱敏感,因此在哺乳細胞的應用中受到限制。目前,以北美螢火蟲(chóng)蟲(chóng)(Photinus pyralis)來(lái)源的熒光素酶基因應用的最為廣泛,該基因可編碼550個(gè)氨基酸的熒光素酶蛋白，是一個(gè)61kDa的單體酶，無(wú)需表達后修飾，直接具有完全酶活。  

       生物熒光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)熒光。螢火蟲(chóng)熒光素酶在Mg2+ 、ATP、O2的參與下,催化D2熒光素(D2luciferin) 氧化脫羧,產(chǎn)生激活態(tài)的氧化熒光素,并放出光子,產(chǎn)生550～580 nm 的熒光,其化學(xué)反應式如下。  這種無(wú)需激發(fā)光就可發(fā)出偏紅色的生物熒光,其組織穿透能力明顯強于綠色熒光蛋白( GFP) 。熒光素酶是靠酶和底物的相互反應發(fā)光,特異性很強,靈敏度高,由于沒(méi)有激發(fā)光的非特異性干擾, 信噪比也比較高。

三  熒光素酶報告基因  

       報告基因（report gene）是一種易于檢測蛋白質(zhì)或酶等表達產(chǎn)物的基因，可通過(guò)報告基因產(chǎn)物的表達來(lái)“報告”目的基因的表達調控。通常把報告基因的編碼序列和基因表達調節序列融合形成嵌合基因,或與其他目的基因融合,在調控序列控制下進(jìn)行表達，通過(guò)報告基因的表達產(chǎn)物來(lái)標定目的基因的表達狀況。 

1  常見(jiàn)的報告基因： 

     β‐半乳糖苷酶（β‐Gal）  

    葡萄糖醛酸酶（GUS） 

     熒光蛋白（GFP）   

    分泌型堿性磷酸酶（SEAP）  

    熒光素酶（LUC）

2  報告基因簡(jiǎn)單實(shí)驗流程  

    構建包含有報告基因的質(zhì)粒   

    將構建好的質(zhì)粒轉染細胞   

    提供相應的刺激（誘導）  

    檢測報告基因  
     數據分析 

3  熒光素酶作為報告基因的優(yōu)勢：

     內源性低，哺乳動(dòng)物無(wú)內源性表達   

    熒光素酶檢測不受細胞內其他物質(zhì)影響   

    發(fā)光檢測，檢測方便    

    靈敏度高，10‐20摩爾熒光素酶分子  

    檢測范圍廣，大于7個(gè)數量級

4、其他報告基因

       正因為熒光素酶與底物的結合特異性很強，檢出的靈敏度高，沒(méi)有激發(fā)光的非特異性干擾，信噪比較高，具有其他報告基因不可替代的優(yōu)勢，它作為報告基因顯示出良好的前景。熒光素酶已成為醫學(xué)研究領(lǐng)域的重要工具, 在基因工程研究中被廣泛作為報告基因用于單個(gè)細胞、轉基因生物、動(dòng)物和人體基因表達的實(shí)時(shí)、低光成像,是一種非常實(shí)用的研究方法，對于推動(dòng)基因工程研究的發(fā)展具有重要作用。

四  熒光素酶報告基因的檢測方法  

       依賴(lài)生物發(fā)光特性,利用閃爍計數器( scintillationcounter) 對熒光素酶的活性作出定量檢測。在標準反應條件下,加入超量底物,經(jīng)一定時(shí)間內,熒光閃爍總數與樣品中存在熒光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自顯影法對熒光素酶進(jìn)行定性檢測。  

五  利用MicroChemi檢測植物葉片中的熒光素酶生物發(fā)光  
     1. 打開(kāi)MicroChemi相機開(kāi)始制冷   
     2.將植物葉片噴加發(fā)光底物（噴底物的過(guò)程需遮光） 
     3. 將樣品置入MicroChemi暗室室溫孵育10min（孵育時(shí)間隨樣品而定）  
     4. 打開(kāi)MicroChemi軟件，設置拍攝參數   
     5.利用binning3x3，每10分鐘曝光一次，共曝光三張  
     6.添加偽彩，調節照片的對比度，得到最佳照片

附：利用MicroChemi2.0檢測煙草葉片中熒光素酶的發(fā)光，曝光10min，binning3x3

（本文轉載丁香園）