基因芯片檢測原理  

       信號的檢測是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結構及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupled device camera，CCD)攝像機等弱光信號探測裝置。此外，大多數DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號強度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線(xiàn)性響應也是非常重要的。雜交信號探測系統主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個(gè)部分組成。

       由于所使用的標記物不同，因而相應的探測方法也各具特色。大多數研究者使用熒光標記物，也有一些研究者使用生物素標記，聯(lián)合抗生物素結合物檢測DNA化學(xué)發(fā)光。通過(guò)檢測標記信號來(lái)確定DNA芯片雜交譜型。      

1．熒光標記雜交信號的檢測方法     

      用熒光標記物的研究者最多，因而相應的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測樣品中的混合熒光標記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際應用中可接近由數值孔徑和光波長(cháng)決定的空間分辨率，而在傳統的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎。大多數方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎上發(fā)展起來(lái)的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象 以熒光物質(zhì)標記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經(jīng)過(guò)SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。

（1）激光掃描熒光顯微鏡     
       探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計算機控制的二維傳動(dòng)平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數轉換板轉換為數字信號。通過(guò)計算機控制傳動(dòng)平臺X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號構成雜交信號譜型，送計算機分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類(lèi)型的DNA芯片及大規模DNA芯片雜交信號檢測，廣泛應用于基因表達、基因診斷等方面研究。 

（2）激光掃描共焦顯微鏡     

       激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結構非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號的探測，而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設計的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與DNA樣品雜交。當用激發(fā)光照射使熒光標記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的DNA樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中DNA所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開(kāi)來(lái)是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號的同時(shí)，避開(kāi)樣品池中熒光信號的影響。一般采用氬離子激光器（488nm）作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計數的模式下接收。經(jīng)模數轉換反轉換為數字信號送微機處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來(lái)自樣品池的未雜交分子熒光信號，避免其對探測結果的影響。激光器前也放置一個(gè)小孔光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處光斑半徑，使之能夠只照射在單個(gè)探針上。通過(guò)計算機控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現對芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(cháng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(cháng)，比較適合研究用?，F在A(yíng)ffymetrix公司已推出商業(yè)化樣機，整套系統約 12萬(wàn)美元。

（3）采用了CCD相機的熒光顯微鏡  

       這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測，因而激發(fā)光照射光場(chǎng)為整個(gè)芯片區域，由CCD相機獲得整個(gè)DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強的高斯分布，會(huì )使得光場(chǎng)光強度分布不均，而熒光信號的強度與激發(fā)光的強度密切相關(guān)，因而不利于信號采集的線(xiàn)性響應。為保證激發(fā)光勻場(chǎng)照射，有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過(guò)傳統的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上，照明面積可通過(guò)更換物鏡來(lái)調整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用。

（4）光纖傳感器     

       有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結合于每根光纖的遠端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠端浸入到熒光標記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維束傳導來(lái)自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導熒光信號返回到熒光顯微鏡，由CCD相機接收。每根光纖單獨作用互不干擾，而溶液中的熒光信號基本不會(huì )傳播到光纖中，雜交到光纖遠端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進(jìn)而反復使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數目有限，因而不便于制備大規模DNA芯片，有一定的應用局限性。

2.生物素標記方法中的雜交信號探測     

       以生物素（biotin）標記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結合物（如結合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結合的分子種類(lèi)繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標記的。  

       目前應用較多的是美國General Scanning公司開(kāi)發(fā)的基因芯片專(zhuān)用檢測系統(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號采集，由計算機處理熒光信號，并對每個(gè)點(diǎn)的熒光強度數字化后進(jìn)行分析。近期又開(kāi)發(fā)出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。

3、 結果的分析   

       樣品在被測定前，首先要經(jīng)過(guò)消化，使待測組織細胞中的DNA或RNA釋放出來(lái)，在經(jīng)過(guò)適當的擴增后，以熒光標記物標記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置（Fluidics Station）中，由其自動(dòng)控制反應的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應條件，進(jìn)行雜交，這一過(guò)程，僅需要數秒鐘。雜交完成后，要對基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測。這種顯微鏡，將聚焦的平面設定為芯片的表面，因此可以檢測結合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標記，而待測樣品中未與芯片上探針結合的熒光標記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。樣品與探針的錯配是影響雜交反應結果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對時(shí)產(chǎn)生的熒光信號要比錯配時(shí)強的多，因此，通過(guò)對信號強度的分析，就可以區分正確與錯誤的配對。   

       為了使結果的檢驗更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統中采用了基因陣列掃描儀和專(zhuān)用的基因芯片工作站，對一幅包含數萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數小時(shí)內，就可以完成用傳統方法需要數月才能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜交分析試驗。

  （本文轉載丁香通）