實(shí)驗原理及技術(shù)背景1：

       原位雜交組化（ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交，再應用標記物的檢測系統，在核酸原有的位置將其顯示出來(lái)的一種檢測技術(shù)。原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使其有特異序列的單鏈探針通過(guò)堿基互補配對規則與組織細胞內待測的核酸復性結合而使得組織細胞中的特異性核酸得到定位，并通過(guò)探針上所標記的檢測系統將其在核酸的原有位置上顯示出來(lái)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。探針的種類(lèi)按所帶標記物可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類(lèi)。目前，大多數放射性標記發(fā)是通過(guò)酶促反應將標記的核苷酸摻入DNA中，常用的同位術(shù)標記物有³H、³⁵S、¹²⁵I、³²P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背景較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于反射性核素對人和環(huán)境均會(huì )造成傷害，近年來(lái)有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。

 

實(shí)驗步驟：

雜交與顯色

       1、將加入探針的雜交液先于50℃預熱，均勻涂于切片表面，加上硅化蓋玻片，放于濕盒中，50℃孵育12-16h。

       2、1×SSC（含50%甲酰胺），50℃洗滌2次，每次10min。

       3、2×SSC（含50%甲酰胺），37℃洗滌10min。

       4、2×SSC（0.5ug/ml RNaseA），37℃洗滌30min。

       5、1×SSC，50℃洗滌10min。

       6、1×PBS（含0.1%Tween20），50℃洗滌2次，每次10min。

       7、PBT室溫洗滌10min。

       8、封閉液處理1-1.5h。

       9、加抗體（用封閉劑按1:500比例稀釋?zhuān)?，均勻地涂于切片表面，放于濕盒中，室?/span>1-2h后4℃過(guò)夜（抗體1:500稀釋于1×封閉液）。

       10、PBT洗滌3次，每次15min。

       11、顯色緩沖液洗5min。

       12、滴加顯色液，黑暗中顯色至適度?？稍陲@微鏡下多次觀(guān)察。

       13、顯色終止液洗10min，雙蒸水洗5次。

       14、甲基綠（0.25%）滴加染色幾秒中，雙真水洗5min。

       15、脫水封片。

 

注意事項：

       1 原位雜交固定的目的是為了保持細胞結構，最大限度地保存細胞內DNA或RNA的水平，使探針易于進(jìn)入細胞或組織。DNA較穩定，RNA易被酶解，在RNA定位上，若要使RNA的降解減少到最低限度，取材后應盡快予以冷凍或固定。

       2 玻片包括蓋片和載玻片用熱肥皂水刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%乙醇中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過(guò)夜除去所有RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無(wú)塵存放。

       3 由于在手指皮膚及實(shí)驗玻璃皿上均可能有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗結果，在整個(gè)雜交前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。

       4 整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，切勿切片干燥，否則會(huì )嚴重影響實(shí)驗結果。

 

附表1：部分試劑配制

       1 0.1mol/L三乙醇胺-0.25%乙酸酐：三乙醇胺13.2ml，氯化鈉5g，濃鹽酸4ml，DEPC水定容至約1000ml，臨用前，一邊搖動(dòng)溶液一邊加入乙酸酐2.5ml，充分混合。

       2 10×PBS：氯化鈉 80g，Na₂HPO₄·12H₂O₂ 32.3g，NaH₂PO₄·2H₂O₂ 4.5g。加DEPC水900ml，用HCl/NaOH調pH至7.2，最后定容為1000ml。

       3 20×SSC（pH=7.0）：氯化鈉175.3g，枸櫞酸鈉88.2g，DEPC水（ddH₂O）定容至1L。

       4 100×Denhardts：Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，DEPC水定容至50mL。

       5 預雜交液：2×SSC，50%甲酰胺，100ug/ml變性魚(yú)精DNA，5×Denhardts。

       6 雜交液：2×SSC，50%甲酰胺,1×Denhardts,250μg/mL酵母tRNA或100μg/mL變性魚(yú)精DNA,10mmol/L Tris-HC1 (pH7.5)，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯，標記探針。

       7 PBT：1×PBS，0.1％Triton×100，2mg/mL BSA使用前加入。

       8 封閉液：0.1mol/L Tris-HCI pH7.5，0.15mol/L NaCI，0.5％羊血清或2％BSA。

       9 顯色緩沖液：100mmol/L Tris-HCI pH9.5，100mmol/L NaCI，50mmol/L MgCl₂。

       10 顯色液：4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP，用顯色緩沖液配制。

       11 顯色終止液：0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA。

 

附2：探針的選擇與標記

1.探針選擇

        特異性的探針必須是一段已知的基因片段。相對于膜上雜交而言，原位雜交有特殊性。即細胞和組織中的待測基因隱藏于類(lèi)似于網(wǎng)絡(luò )狀的立體結構之中，給探針的進(jìn)入帶來(lái)明顯的影響。探針能接觸到靶分子對原位雜交尤為重要。理想的探針應滿(mǎn)足下列要求：?適當的探針長(cháng)度。?能對探針進(jìn)行高效率的標記。?能長(cháng)期保持穩定。核酸探針多種多樣，基本上可分為DNA、RNA和人工合成寡核苷酸三大類(lèi)。

     （1）.DNA和RNA探針

        其原理是克隆一段特異的DNA或RNA片段，裝載到相應的質(zhì)粒中。經(jīng)過(guò)質(zhì)粒擴增，酶解和純化等步驟，就可以得到大量的DNA和RNA片段。更好的解決辦法是直接購買(mǎi)純化好的探針，其次是獲得一裝載好特異性DNA或cDNA片段的質(zhì)粒。目前在國際國內都有商品化的DNA探針供應，這些探針已經(jīng)嚴格純化和定量。

     （2） 寡核苷酸探針

        在待查基因序列已知的情況下，簡(jiǎn)單而又經(jīng)濟的用途是合成寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的長(cháng)度一般為10-100bp，探針越短，滲透性越好，但結合不太穩固。探針越長(cháng)則合成成本上升，也沒(méi)有必要。最好是長(cháng)度20-30bp的寡核苷酸探針。合成探針的時(shí)候可以摻入半抗原如地高辛、生物素和FITC等。寡核苷酸探針也可用3′末端標記法予以標記。                     

 

2.探針標記

       各種不同類(lèi)型的探針需要經(jīng)過(guò)恰當的標記，才能在原位雜交中應用。DNA探針一般采用的標記方法為隨機引物標記和缺口平移法。寡核苷酸探針則主要采用3＇末端標記。目前標記方法分為放射性核素標記和班抗原標記兩種（包括生物素）。放射性核素標記的優(yōu)點(diǎn)是敏感性特別高，特異性也比較好。缺點(diǎn)是藥有放射性核素有關(guān)的處理經(jīng)驗，存在著(zhù)對人體的潛在危害性，班抗原標記的典型代表是地高辛、FITC和生物素。其最大的優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有放射性核素的潛在危害性，同時(shí)也有較高的敏感性和特異性。

 

（本文轉載丁香園）