強直性脊柱炎（AS）是一種以脊柱為主要病變的慢性自身免疫性疾病,該病的發(fā)展會(huì )造成不同程度的骨骼、肌肉、眼、肺病變。雖然這是一種很古老的疾病，幾千年前古埃及人的骨骼中就發(fā)現有強直性脊柱炎的證據，在2000年以前希臘名醫希波克拉底就對此病進(jìn)行了描述，但其病因和致病機理卻至今尚未闡明。但在眾多病因研究結果中，遺傳基因HLA-B*27是最受公認的誘因，它與AS的相關(guān)性早在40年前就被認識到了。因此檢測該基因的攜帶情況對AS的診斷具有很大幫助，本文將著(zhù)重介紹該基因的基因芯片檢測技術(shù)。

HLA的結構功能：
      HLA（人類(lèi)白細胞抗原）又稱(chēng)人類(lèi)主要組織相容性復合物（MHC）。HLA基因位于人類(lèi)第6號染色體上, 包括I, II, III類(lèi)基因, HLA-B*27就是屬于HLA-I類(lèi)基因中B座位上的第27主型。依據IMGT/HLA database顯示目前已發(fā)現HLA-B*27有78種亞型，從HLA-B*2701到HLA-B*2779，各種亞型之間僅僅是少數幾個(gè)堿基的差別(Release 3.3.0,14-January-2011)。
   
      HLA-B*27基因編碼的a肽鏈（重鏈）與b2微球蛋白（輕鏈）形成二聚體分子（HLA-I類(lèi)分子）。該分子分布于有核細胞的表面，具有特定結構的內源性抗原的提呈功能?？乖诎麧{內經(jīng)酶降解成小的肽片段，在內質(zhì)網(wǎng)與HLA-B*27編碼產(chǎn)生的HLA-I類(lèi)分子專(zhuān)一性結合成復合物，然后轉送到細胞膜表面，供CD8+ T細胞識別，從而激活該細胞。此外，早期T細胞在胸腺中發(fā)育為成熟T細胞的過(guò)程中，也必須與表達HLA-Ⅰ類(lèi)分子的胸腺上皮細胞接觸才能分化成CD8+ T細胞。

HLA-B*27的臨床意義：
      近四十年來(lái)，全球各地關(guān)于HLA-B*27和強直性脊柱炎關(guān)聯(lián)的調查研究一方面強烈提示兩者之間的密切關(guān)聯(lián)，如Brown等研究發(fā)現強直的患者中90%攜帶HLA-B*27基因^[1],撒哈拉以南非洲的人群普遍存在HLA-B*27基因缺失，同時(shí)該地區AS的發(fā)病也極為罕見(jiàn)^[2]。另一方面，約有3%-6%HLA-B*27基因攜帶者發(fā)展成強直患者。進(jìn)一步研究發(fā)現，在眾多的HLA-B*27亞型中HLA-B*2702, HLA-B*2704和HLA-B*2705亞型與AS的相關(guān)性最強，而HLA-B*2706和HLA-B*2709亞型的發(fā)病風(fēng)險最弱^[3,4].中國人群的研究顯示HLA-B*2704與AS的相關(guān)性高于HLA-B*2705^[5,6]。盡管HLA-B*27指標的檢測未成為AS的診斷標準，但對于A(yíng)S與類(lèi)似癥狀疾病的鑒別診斷以及疾病的早期預測和輔助診斷有極高的陰性預期值和風(fēng)險系數(HLA-B27陽(yáng)性個(gè)體患SpAs的危險性較陰性者大100倍)^[7]，并且HLA-B*27基因的研究也為闡明AS病理機制和探索治療方法的提供了實(shí)驗依據。
   
       目前HLA-B*27與AS的關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)拓展到其他類(lèi)型的脊柱關(guān)節炎(SpA)，包括賴(lài)特綜合征（RS）、反應性關(guān)節炎（ReA）、外周關(guān)節炎、銀屑病關(guān)節炎(PA)、幼年發(fā)病的脊柱關(guān)節?。↗SpA）和炎癥性腸病(IBD)。研究顯示HLA-B*27與上述疾病也有一定的相關(guān)性^[7]。

 
HLA-B*27的檢測方法：
       實(shí)驗室的檢測分為兩大類(lèi)。一種是檢測細胞膜表面HLA-B*27編碼的蛋白。最早的檢測方法是淋巴細胞毒試驗，取受檢者淋巴細胞，加入到特異性抗體包被的微孔中溫育，HLA-B*27陽(yáng)性細胞會(huì )被之后加入的補體激活而啟動(dòng)細胞毒殺傷程序，凋亡的細胞最終通過(guò)染色被識別。這種方法是經(jīng)典的檢測方法，也已成為之后發(fā)展的新方法的參照標準，但缺點(diǎn)是蛋白檢測的敏感性不夠高，需要新鮮活細胞樣本，操作繁瑣，結果判讀中的主觀(guān)因素影響較大，同時(shí)抗原抗體結合中的HLA-B7的交叉反應也影響了結果的特異性^[8]。新發(fā)展的基于流式細胞術(shù)的檢測方法，同樣需要采集新鮮淋巴細胞，混入預先標記熒光素的特異性抗體，溫育后洗滌，通過(guò)流式細胞儀對陽(yáng)性細胞計數。這種方法在結果判讀上實(shí)現了客觀(guān)化、標準化和自動(dòng)化，相對于前者是一個(gè)很大的進(jìn)步，但仍然無(wú)法解決交叉反應和一定要使用新鮮樣本的問(wèn)題。
  
       另一種是檢測特異的DNA序列。這一類(lèi)方法需要獲取受檢者的基因組DNA，運用HLA-B*27片段特異的引物進(jìn)行PCR擴增，檢測樣本中是否攜帶HLA-B*27。這種方法的關(guān)鍵在于設計引物時(shí)，需要通過(guò)選擇其3’端堿基在靶序列上的結合位點(diǎn)，以達到只有HLA-B*27片段獲得擴增，而非其他HLA-B等位基因的目的, 這種方法稱(chēng)為序列特異性引物PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR-SSP法。該方法時(shí)效快，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需新鮮樣本。但是其假陽(yáng)性率偏高一直是該法被詬病的原因。隨后發(fā)展起來(lái)的PCR-SSOP法（序列特異性寡核苷酸探針PCR），采用一段與HLA-B*27 PCR擴增產(chǎn)物特異性配對的寡核苷酸探針，再次篩檢PCR產(chǎn)物，很大程度上降低了PCR-SSP法的假陽(yáng)性率，提高了檢測的特異性。
 
       運用PCR-SSOP法的原理，將針對HLA-B*27擴增產(chǎn)物的特異性寡核苷酸探針預先固定在玻璃等低干擾的材質(zhì)上，對PCR-SSP產(chǎn)物進(jìn)行篩檢，如樣本中攜帶HLA-B*27，特異性探針就能與目標產(chǎn)物結合，發(fā)出熒光信號，被儀器檢測到，這種產(chǎn)品就是俗稱(chēng)的基因芯片?；蛐酒夹g(shù)被認為是現代臨床檢驗的發(fā)展方向，原因就在于其基于高敏感性的基因擴增技術(shù)，通過(guò)序列特異性引物和探針，實(shí)現檢測結果的高特異性，而且可以在小尺寸的材料上固定大量的探針，通過(guò)自動(dòng)化設備的運用，滿(mǎn)足臨床檢測高通量、標準化需求。

       HLA-B*27的基因芯片檢測技術(shù)涉及了從基因組DNA制備、特異性基因片段擴增到產(chǎn)物篩檢等一系列環(huán)節。因此基因芯片檢測體系的設計不但針對PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的篩選，也同時(shí)兼顧了上述檢測環(huán)節的質(zhì)量控制。為此該體系包含了以下一系列的質(zhì)控物質(zhì)：
        DNA陽(yáng)性質(zhì)控：針對DNA制備是否成功以及PCR擴增過(guò)程有無(wú)差錯的質(zhì)控問(wèn)題，HLA-B*27的基因芯片檢測體系包含了兩種陽(yáng)性質(zhì)控物質(zhì)，即PCR反應液中用以擴增β2微球蛋白基因片段的特異性引物和在芯片上包被的檢測β2微球蛋白基因擴增產(chǎn)物的探針。β2微球蛋白廣泛存在于有核細胞的細胞膜表面，而且序列保守程度高。如果最終檢測結果顯示該探針并未與PCR產(chǎn)物發(fā)生特異性結合，即說(shuō)明在DNA制備或者PCR過(guò)程中發(fā)生錯誤。

        HLA-B*27陽(yáng)性對照：除了為實(shí)驗流程設置的DNA陽(yáng)性質(zhì)控外，體系還引入了HLA-B*27陽(yáng)性對照，用于檢驗HLA-B*27引物是否正常工作。質(zhì)控物包括添加于PCR反應液中的一段人工合成寡核苷酸，以及芯片上的探針。反應液中的寡核苷酸的3’端部分是和HLA-B*27引物互補的序列，其余的5’端部分是一段重復堿基序列，探針也是一段相同的重復堿基序列，如果引物成功工作，最終能檢測到熒光信號。

        PCR特異性質(zhì)控：如何避免PCR過(guò)程中的非特異性產(chǎn)物？質(zhì)控物包括添加在PCR反應液中的一段人工合成寡核苷酸，以及芯片上的探針。反應液中的寡核苷酸的3’端部分是和HLA-B*27引物不完全互補的序列，其余的5’端部分是另一段重復序列，探針也是與之相同的重復序列。如果無(wú)非特異性反應發(fā)生，不會(huì )產(chǎn)生可以與探針互補的擴增產(chǎn)物。最終，沒(méi)有信號產(chǎn)生。

        雜交過(guò)程的質(zhì)控物：SSOP相對于SSP法多出雜交的反應流程，因此相對于SSP需要設計雜交過(guò)程的質(zhì)控物。這類(lèi)質(zhì)控物包括雜交液中含有的一段熒光標記的人工合成寡核苷酸，和芯片上包被的兩條探針，其中一條可以和熒光標記的質(zhì)控物完全互補，另一條卻不完全互補。如果最終檢測結果顯示前者的信號強度明顯高于后者，提示具有良好的雜交特異性。

       如上所述，目前已知HLA-B*2706或B*2709是與AS發(fā)病無(wú)關(guān)的亞型，甚至有學(xué)者認為這兩者起保護作用，因此確定樣品中是否存在這兩種亞型，對AS的診斷具有很重要的輔助意義，而蛋白檢測很難做到這一點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)分別通過(guò)2對引物，同時(shí)擴增外顯子2和外顯子3，隨后通過(guò)2條特異性探針?lè )謩e檢測這兩段擴增產(chǎn)物。在此，引物特別設計成：外顯子3的引物不能擴增HLA-B*2706和B*2709。因此當最終探針檢測結果顯示外顯子2和3均為陽(yáng)性或僅外顯子3陽(yáng)性而外顯子2陰性時(shí)，就排除了樣本中HLA-B*2706和B*2709的存在，為AS的確診提供了極有價(jià)值的參考。
 
       序列特異性引物和探針的運用加上多點(diǎn)質(zhì)控的引入不但使HLA-B*27基因芯片檢測的準確性要高于PCR-SSP技術(shù)，而且相對于抗原檢測更能有效避免HLA-B7的交叉反應，實(shí)現無(wú)關(guān)亞型的鑒別診斷。同時(shí)在操作方面，這種技術(shù)不要求活細胞，因此可以收集樣本集中檢測，有效節省人力成本和試劑成本。但是，由于基因產(chǎn)物表達過(guò)程還受到復雜的遺傳調控和組織環(huán)境因素影響，因此蛋白檢測也不容忽視，兩種檢測的意義并不等同。在實(shí)驗室的檢測中，我們需要充分了解各種方法的優(yōu)劣，根據試驗目標來(lái)選擇最佳的方法或最優(yōu)的檢測方案。有機的結合兩類(lèi)方法，不僅僅能提高檢測結果的精準性，同時(shí)對研究疾病遺傳和表觀(guān)性質(zhì)也極具價(jià)值。

     (本文轉載丁香通）