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質(zhì)粒提取

 

1.溶液I—溶菌液:

   菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時(shí),溶菌酶作用受到抑制。

   葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA受機械剪切力作用而降解。 

   EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。
 
2.溶液II-NaOH-SDS液:
   NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是穩定的。但當pH>12或pH<3時(shí),就會(huì )引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時(shí),該系統的pH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
   SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1)溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。(2)解聚細胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)的復合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過(guò)程中,必須把它去除干凈,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。
 
3. 溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:
    NaAc的水溶液呈堿性,為了調節pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液,調回pH至中性,使變性的質(zhì)粒DNA能夠復性,并能穩定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復合物,使沉淀更完全。
 
4.為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA?
    用無(wú)水乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會(huì )起任何化學(xué)反應,對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。
 
   DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩定存在,當加入乙醇時(shí),乙醇會(huì )奪去DNA周?chē)乃肿?,使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗中,是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇(因為無(wú)水乙醇的價(jià)格遠遠比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時(shí),就會(huì )影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙酵,最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
 
5.在用乙醇沉淀DNA時(shí),為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1~0.25mol/L?
   在pH為8左右的溶液中,DNA分子是帶負電荷的,加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當加入的鹽溶液濃度太低時(shí),只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不完全,當加入的鹽溶液濃度太高時(shí),其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在,影響DNA的酶切等反應,必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。
 
6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理?
    加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì),為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀,再加KAc使這些復合物轉變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復合物,使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。
 
7.為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中,一般采用TE緩沖液?
    在基因操作實(shí)驗中,選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(pKa=7.2)和硼酸系統(pKa=9.24)等雖然也都符合細胞內環(huán)境的生理范圍(pH),可作DNA的保存液,但在轉化實(shí)驗時(shí),磷酸根離子的種類(lèi)及數量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反應時(shí),不同的酶對輔助因子的種類(lèi)及數量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統,由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時(shí),大都采用Tris-HCl系統,而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。
 
8.如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來(lái)沉淀DNA?
    采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達20%。本實(shí)驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30% PEG,其最終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。
 
9.抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí),怎樣使用酚與氯仿較好?
    酞與氯仿是非極性分子,水是極性分子,當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時(shí),蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去,使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心,變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大,因而與水相分離,沉淀在水相下面,從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機溶劑比重更大,保留在最下層。
 
   作為表面變性的酚與氯仿,在去除蛋白質(zhì)的作用中,各有利弊,酚的變性作用大,但酚與水相有一定程度的互溶,大約10%~15%的水溶解在酚相中,因而損失了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作用不如酚效果好,但氯仿與水不相混溶,不會(huì )帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中,混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚,由于酚與氯仿是互溶的,可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì),此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí),將酚與氯仿混合(1:1)使用。
 
10.為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí),還要加少量的異戊酵?
    在抽提DNA時(shí),為了混合均勻,必須劇烈振蕩容器數次,這時(shí)在混合液內易產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì )阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力,所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24:1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25:24:1(不必先配制,可在臨用前把一份酚加一份24:1的氯仿與異戊醇即成),同時(shí)異戊醇有助于分相,使離心后的上層水相,中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。
 
11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化?
    因為酚與水有一定的互溶,苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中,不致吸收樣品中含有DNA的水分,減少DNA的損失。用Tris調節至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或堿性條件下(pH5~7),RNA比DNA更容易游離到水相,所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。
 
    保存在冰箱中的酚,容易被空氣氧化而變成粉紅色的,這樣的酚容易降解DNA,一般不可以便用。為了防止酚的氧化,可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1%。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末,不僅能抗氧化,并在一定程度上能抑制DNase的活性,它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚,最好分裝在棕色小試劑瓶里,上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液,隔絕空氣,以裝滿(mǎn)蓋緊蓋子為宜,如有可能,可充氮氣,防止與空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或-20℃冰箱中,使用時(shí),打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋,這樣可使酚不變質(zhì),可用數月。

 

  (本文轉載丁香園)

 

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