ELISA，即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗，其基本原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過(guò)物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標本，通過(guò)酶標物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。ELISA技術(shù)作為免疫標記技術(shù)（包含免疫熒光技術(shù)，免疫放射技術(shù)，免疫酶技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)）中的一種，已廣泛應用于科研和臨床實(shí)驗中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特點(diǎn)。

      在ELISA實(shí)驗方法中，比較常見(jiàn)的方法有雙抗體夾心法，競爭法，間接法，雙抗原夾心法，捕獲法，下面對此一一詳述。

1.雙抗體夾心法
      雙抗體夾心法，其基本原理是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無(wú)關(guān)蛋白載體封閉未結合位點(diǎn)，然后加入待檢標本，通過(guò)加入檢測抗體，酶標記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關(guān)。

      該方法的適用條件是：含有多個(gè)抗原表位的大分子物質(zhì)。因為這種檢測方法需要兩種抗體，所以就涉及抗體配對的問(wèn)題。一般而言，常用的抗體配對方法有一下幾種：包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗；包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對的抗原表位不同；包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般是來(lái)源于不同的宿主。

      這種檢測方法在應用酶標第二抗體時(shí)，應該注意的一個(gè)原則是：第二抗體必須只能針對檢測抗體，而不能針對包被抗體。鑒于酶標二抗的局限性，現在一般廠(chǎng)家都引入生物素親和素放大系統，這種系統在提高反應靈敏度的同時(shí)，應用起來(lái)也更加方便，我們只需要對檢測抗體進(jìn)行生物素標記，不需要對每一種不同來(lái)源的二抗進(jìn)行酶標記，只需對親和素做HRP標記就可以省去很多繁瑣的工作。
 
2.競爭法
      競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法，這里我們以直接競爭法為例進(jìn)行原理講解。直接競爭法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無(wú)關(guān)蛋白載體封閉未結合位點(diǎn)，加入標準品（樣本）和生物素標記的抗原物質(zhì)進(jìn)行競爭結合，經(jīng)合適的溫度和一定時(shí)間的孵育，洗滌后，加入HRP標記的鏈霉親和素進(jìn)行反應，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負相關(guān)。

      該方法一般用來(lái)檢測具有較少表位的小分子物質(zhì)，當然，這種方法也可以用來(lái)檢測大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測大分子抗原物質(zhì)時(shí)，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒(méi)有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。這種方法在檢測抗體時(shí)，可能由于兩種競爭的抗體來(lái)源不一，導致兩種抗體趨同性不高，就使得檢測結果的可靠性不高。

3.間接法
      間接法一般用來(lái)檢測抗體。其基本原理是：將一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入無(wú)關(guān)蛋白載體封閉未結合位點(diǎn)后，加入待測樣本，然后加入酶標二抗，經(jīng)孵育和洗滌后，加底物顯色。一般而言，在間接法檢測抗體實(shí)驗中，由于酶標二抗的局限性，一般檢測的抗體為總的IgG。

4.雙抗原夾心法
      雙抗原夾心法，與雙抗體夾心法類(lèi)似，基本原理是將已知濃度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面，對未結合位點(diǎn)用無(wú)關(guān)蛋白載體進(jìn)行封閉后，加入待檢樣本，然后加入生物素標記的抗原和HRP標記的鏈霉親和素，經(jīng)TMB顯色和終止反應，酶標儀讀數之后即可計算待測物濃度。雙抗原夾心法與間接法都可以對抗體進(jìn)行檢測，但是前者檢測的是針對該抗原的所有種類(lèi)的抗體，包含IgG, IgM, IgA，IgD, IgE，這是間接法做不到的。

5.捕獲法
      捕獲法一般用來(lái)測定IgM類(lèi)抗體。其基本原理是：將抗IgM 抗體包被于固相微孔板，用無(wú)關(guān)蛋白載體對未結合位點(diǎn)進(jìn)行封閉后，加入待測樣本，接著(zhù)加入抗原物質(zhì)，然后加入針對該抗原的經(jīng)生物素標記的特異性抗體和HRP標記的鏈霉親和素，經(jīng)TMB底物顯色和終止反應后即可計算濃度。由于我們檢測樣本中的IgM含量時(shí)，其中同時(shí)含有較高濃度的IgG類(lèi)抗體，在用一般的間接法檢測時(shí)，IgG類(lèi)抗體和IgM類(lèi)抗體會(huì )和固相抗原進(jìn)行競爭性結合，由于IgG占據絕對優(yōu)勢，勢必導致IgM類(lèi)抗體能夠結合上去的量相當有限，最終導致的結果是假陰性。

（本文轉載丁香園）