一、脫蠟和水化

      方法同SP法。

二、第一抗體的染色

      1、將切片浸在3%H2O2甲醇溶液（新鮮配制）中10min，PBS沖洗3min×3次；

      2、加100ul（2滴）血清封閉溶液（試劑1）到切片上，室溫孵育10min，倒掉（不能沖洗）；

      3、加入一抗（按照說(shuō)明書(shū)推薦濃度和孵育條件）；

      4、使用含有0.05%吐溫20的PBS（TPBS），沖洗5min×3次；

      5、加入100ul（2滴）生物素化的二抗（試劑2)，室溫孵育10min；

      6、用TPBS沖洗5min×3次；

      7、加入100ul（2滴）鏈霉親和素-AP（試劑3）的二抗，室溫孵育10min；

      8、用TPBS沖洗5min×3次；

      9、準備底物溶液：將1滴試劑4A和4B加入到1ml去離子水中，充分混勻。再加入1滴試劑4C，充分混勻；

      10、加100ul（2滴）配好的AP底物溶液，室溫孵育（鏡下掌握孵育時(shí)間）；

      11、使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應。

三、第二抗體的染色

      12、加100ul（2滴）雙染增強劑（試劑7），孵育；

      13、用TPBS沖洗3min×3次；

      14、加100ul（2滴）血清封閉溶液（試劑1）到切片上，室溫孵育10min，倒掉（不能沖洗）；

      15、加入稀釋好的一抗（按照說(shuō)明推薦濃度和孵育條件）；

      16、用TPBS沖洗5min×3次；

      17、加入100ul（2滴）生物素化的二抗（試劑2)，室溫孵育10min；

      18、用TPBS沖洗5 min×3次；

      19、加入100ul（2滴）鏈霉親和素-HRP（試劑5）的二抗，室溫孵育10min；

      20、用TPBS沖洗5min×3次；

      21、準備底物溶液：將1滴試劑6A和6B加入到1ml去離子水中充分混勻。再加入1滴試劑6C，充分混勻；

      22、加100ul（2滴）配好的HRP底物溶液，室溫孵育（鏡下掌握孵育時(shí)間）；

      23、使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應；

      24、使用復染試劑染色（根據需要選擇）；

      25、封片劑（試劑8）封片，顯微鏡觀(guān)察并拍照。

  （本文轉載丁香園）