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免疫組化雙染實(shí)驗流程

 

一、脫蠟和水化

 

      方法同SP法。

 

二、第一抗體的染色

 

      1、將切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鮮配制)中10min,PBS沖洗3min×3次;

      2、加100ul(2滴)血清封閉溶液(試劑1)到切片上,室溫孵育10min,倒掉(不能沖洗);

      3、加入一抗(按照說(shuō)明書(shū)推薦濃度和孵育條件);

      4、使用含有0.05%吐溫20的PBS(TPBS),沖洗5min×3次;

      5、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(試劑2),室溫孵育10min;

      6、用TPBS沖洗5min×3次;

      7、加入100ul(2滴)鏈霉親和素-AP(試劑3)的二抗,室溫孵育10min;

      8、用TPBS沖洗5min×3次;

      9、準備底物溶液:將1滴試劑4A和4B加入到1ml去離子水中,充分混勻。再加入1滴試劑4C,充分混勻;

      10、加100ul(2滴)配好的AP底物溶液,室溫孵育(鏡下掌握孵育時(shí)間);

      11、使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應。

 

三、第二抗體的染色

 

      12、加100ul(2滴)雙染增強劑(試劑7),孵育;

      13、用TPBS沖洗3min×3次;

      14、加100ul(2滴)血清封閉溶液(試劑1)到切片上,室溫孵育10min,倒掉(不能沖洗);

      15、加入稀釋好的一抗(按照說(shuō)明推薦濃度和孵育條件);

      16、用TPBS沖洗5min×3次;

      17、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(試劑2),室溫孵育10min;

      18、用TPBS沖洗5 min×3次;

      19、加入100ul(2滴)鏈霉親和素-HRP(試劑5)的二抗,室溫孵育10min;

      20、用TPBS沖洗5min×3次;

      21、準備底物溶液:將1滴試劑6A和6B加入到1ml去離子水中充分混勻。再加入1滴試劑6C,充分混勻;

      22、加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液,室溫孵育(鏡下掌握孵育時(shí)間);

      23、使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應;

      24、使用復染試劑染色(根據需要選擇);

      25、封片劑(試劑8)封片,顯微鏡觀(guān)察并拍照。

 

  (本文轉載丁香園)

 

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