1975年，Kohler和Milstein發(fā)現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進(jìn)行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng )立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫學(xué)與生物學(xué)基礎研究開(kāi)創(chuàng )了新紀元，也為臨床疾病的診斷、預防和治療提供了新的方法。

1. 雜交瘤的基本原理：

 雜交瘤技術(shù)又稱(chēng)單克隆抗體技術(shù)(monoclonal antibody technique)。雜交瘤技術(shù)是使免疫動(dòng)物的脾細胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的誘導下與同系動(dòng)物的骨髓瘤細胞融合。首先是細胞質(zhì)融合，然后通過(guò)有絲分裂細胞核合而為一，形成新的雜交細胞，簡(jiǎn)稱(chēng)為雜交瘤。細胞融合后移入HAT培養液中培養。骨髓瘤細胞由于缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉化酶（HGRPT），在HAT培養液中不能增殖而死亡。淋巴細胞培養中也不能長(cháng)期在培養液中生長(cháng)增殖。然而雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT的基因產(chǎn)物，并從骨髓瘤細胞中獲得腫瘤細胞不斷生長(cháng)繁殖（傳代）的特性，因此在HAT培養液中選擇性存活下來(lái)。細胞融合后既具有產(chǎn)生特異性抗體的能力。又保留了瘤細胞能體外長(cháng)期培養的特性。

2. 雜交瘤細胞制備：
   （1）骨髓瘤細胞的培養：骨髓瘤細胞（NS-1或SP2/0）在含10～15的小牛血清完全培養液中培養處于對數生長(cháng)期時(shí)，此時(shí)細胞渾圓、透亮，大小均一，排列整齊，呈半致密分布。選擇處于旺盛生長(cháng)，形態(tài)良好的對數生長(cháng)期細胞供融合用。
 
   （2）免疫小鼠：選用8～12周齡雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原為可溶性（蛋白質(zhì)），可按每只鼠一次劑量為10～100μg/只免疫。蛋白質(zhì)抗原與等量弗氏完全佐劑充分混勻，分別注入鼠的頸背部多處或腹腔內，間隔2～4周同法重復，經(jīng)1月后，再用10～100μg（0.1～0.2ml）抗原作靜脈或腹腔加強免疫。細胞與微生物表面抗原一般具有較高的免疫原性，可不加佐劑，直接經(jīng)腹腔或靜脈注入（1～2）×107細胞。一般采用融合前3～4d大劑量靜脈注入抗原，然后取脾做融合實(shí)驗。因此間脾臟B淋巴母細胞-漿細胞比例較高，融合率較高。
 
   （3）脾細胞制備：①放血處死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②在無(wú)菌條件下取脾，至含培養液的小平皿內，去掉脂肪和結締組織，用5ml無(wú)血清培養液沖洗一次。③將脾細胞置細胞網(wǎng)上，加入5ml不完全培養液。用注射器內芯研磨分散脾細胞，將脾細胞收集到離心管內（50ml），加10～20ml培養液，離心（800～1000r／min，10min），棄上清后計數備用。
 
   （4）飼養細胞制備：在體外培養時(shí)，單個(gè)或少數分散的細胞不容易存活與繁殖，必須在加入其他活細胞才易存活與繁殖。通常在融合的前一天或當天用取小鼠腹腔巨噬細胞制作飼養層細胞。（5）細胞融合（雜交）

3.雜交瘤細胞瘤細胞的選擇性培養

   （1）培養：將融合后的細胞懸浮于HAT培養液中，置于含5%～7% CO2，37℃飽和濕度培養箱中培養。
 
   （2）換液：每2～3天更換一半量的培養液一次，在融合兩周內使用HAT培養液，在第12～13天用HT培養液，在第14天后根據細胞增殖情況改用15%～20%FCS完全培養液。
在停用A后，殘留于培養液或細胞內的A仍起一定的阻抑作用，此時(shí)需繼續補加HT培養液，為雜交瘤細胞提供應急的DNA合成途徑。
 
   （3）觀(guān)察：經(jīng)融合劑PEG處理后的細胞，凝集成粗顆粒狀。當天用倒置顯微鏡觀(guān)察，可見(jiàn)2～5個(gè)粘連骨髓瘤細胞，常有融合的巨細胞或啞鈴狀的細胞。

4. 雜交瘤細胞的篩選：

     融合后的細胞在HAT培養基培養后，即有部分培養孔出現雜交瘤細胞集落，而其中僅部分是分泌預定特異性抗體的雜交瘤細胞。因此在培養7～10
d后用倒置顯微鏡觀(guān)察到雜交瘤細胞長(cháng)成約占1/3～1/2視野時(shí)，即可取培養上清液進(jìn)行特異性抗體的檢測，確定有無(wú)分泌單克隆抗體（monoclonal
antibody，McAb）的能力，以便及時(shí)進(jìn)行細胞克隆化。檢測McAb的方法可根據情況進(jìn)行選擇。
 

5. 雜交瘤細胞的克隆化：

    細胞融合成功后，并經(jīng)證實(shí)培養孔中存在預定抗原特異性抗體時(shí)，應盡早將雜交瘤細胞克隆化，其目的是利用單個(gè)細胞培養技術(shù)，從細胞群體中選育出遺傳穩定而同源的細胞系，以獲得分泌單一抗體的雜交瘤細胞系，淘汰遺傳不穩定的雜交瘤細胞。每個(gè)雜交瘤細胞含有來(lái)自?xún)煞N親本細胞全套染色體，但在雜交瘤增殖過(guò)程中，將逐漸丟失染色體，甚而導致McAb產(chǎn)生能力的消失。因此，在篩選抗體陽(yáng)性的雜交瘤細胞時(shí)，須盡早進(jìn)行克隆化，以保持雜交瘤細胞具有同源的子代?？寺』嗖捎糜邢尴♂尫?。
 
   （1）先制備小鼠飼養細胞層，將細胞懸浮與HT（融合后第一次克隆化時(shí)）或含10%FCS -1640培養液中。
 
   （2）用滴管將抗體陽(yáng)性待克隆化細胞孔輕輕吹吸，使細胞與孔底分離，用培養液將細胞懸液稀釋為每ml分別含5、10和50個(gè)細胞的懸液。
 
   （3）將上述稀釋的細胞懸液分別加入已培養有飼養細胞的24孔培養板中，每孔0.1ml（2滴），使相應每孔分別含0.5、1或5個(gè)細胞。
 
   （4）將細胞培養板置于5%～7%CO2、37℃飽和濕度的溫箱中培養，至第四天換培養液一次，第5～6天仔細觀(guān)察各孔內細胞生長(cháng)情況，并在相應的孔蓋板上作標記，記錄克隆生長(cháng)的情況。
 
   （5）特異性抗體的檢測：在克隆后的7～9天，在低倍鏡下如見(jiàn)到細胞克隆布滿(mǎn)1/3～1/2視野時(shí)，即可吸取培養上清液，用免疫學(xué)方法檢測相應的抗體。如測出細胞生長(cháng)孔含有特異性抗體，可選擇抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(cháng)、形態(tài)良好的細胞孔，繼續同法再克隆擴大培養重復3次。如果有單克隆生長(cháng)的每個(gè)孔內的上清都能檢出高滴度抗體，則表明已經(jīng)實(shí)現“克隆化”。

6. 單克隆抗體腹水的制備：

    McAb因其具有高度特異性和能大量制備等特點(diǎn)，故生物試驗和醫藥等領(lǐng)域得到廣泛應用。將雜交瘤細胞接種與同系小鼠或裸鼠腹腔內，可誘生腫瘤和含McAb的腹水，并可有效保存雜交瘤細胞株和分離已經(jīng)污染雜菌的雜交瘤細胞株。
 
   （1）在接種瘤細胞1～2周前，先給小鼠腹腔注射液體石蠟油或降植烷0.5ml，同批小鼠預處理后可用2個(gè)月左右。
 
   （2）1周后每只小鼠腹腔注射5×105～5×106雜交瘤細胞。先洗滌一次，以營(yíng)養液調其濃度。
 
   （3）注射雜交瘤8～10天后，小鼠腹部明顯脹大時(shí)，消毒小鼠腹部，用針頭刺入小鼠下腹部，并輕揉其腹部，慢慢抽出腹水。一次抽5～8ml，待2～3
d后，腹水積聚，用同法反復抽，一般可抽2～3次。腹腔內產(chǎn)生腫瘤和腹水，抗體含量可達1 mg／ml。
 
   培養上清液中抗體含量低且混有大量血清蛋白，而腹水中雖然抗體含量高，但也混有蛋白，需進(jìn)行純化及鑒定其特性。 

（本文轉載丁香園）