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免疫共沉淀(co-IP)實(shí)驗案例分享

 

—— co-IP 檢測 Hsp90 與 Cdc37 結合情況

 

1、實(shí)驗材料

   

      SKBR3 細胞,PMSF(Amresco,cat:329-98-6),cocktail,脫脂奶粉(cat:66196131T),β-actin。Anti-Hsp90(santa,cat:sc-69703)、Anti-Cdc37(santa,cat:sc-13129)、Protein A+G agrose(Beyotime),細胞刮,4 度離心機(eppendorf,centrifuge 5415R),搖床(ORBITAL SHAKER,TS-1000),電泳儀(Tanon EPS300)。低速離心機(cat:TDZ4B-WS)。

 

2、實(shí)驗方法

 

制樣:

 

      ? 細胞裂解液配制:基礎裂解液中加入 PMSF,cocktail 和 DTT

      ? 實(shí)驗分組:Control 組 、化合物 11(10μM)、化合物 11(20μM)、化合物 11(40μM),給藥時(shí)間 24 h。

      ? 棄培養上清,PBS 洗一遍,冰上加入 150ul/孔裂解液。

      ? 于冰上裂解30 min,為使細胞充分裂解培養瓶要經(jīng)常來(lái)回搖動(dòng)。

      ? 裂解完后,于 4℃ 下 12000rpm 離心 15 min。

      ? 收集蛋白上清,取少許裂解液用于后續檢測各蛋白表達情況。

      ? 剩余的裂解液加入 Anti-Cdc37,4℃ 緩慢搖晃孵育過(guò)夜。

      ? 用適量裂解緩沖液預處理 ProteinA+G,20uL/管加入各抗體孵育過(guò)夜的細胞裂解液中,4℃ 緩慢搖晃孵育 2~4 h。

      ? 免疫沉淀反應后,4℃,3000rpm,3 min,小心吸取上清,瓊脂糖珠用 1 mL 
      ? 裂解液沖洗 3-4 次,最后加入 15uL 2*SDS 上樣緩沖液,100℃,5 min。

      ? Laemmli-SDS-PAGE

 

電泳:

 

      電泳時(shí)根據情況每塊膠 15mA 恒流電源;根據預染 Marker 和目的蛋白的分子量大小的相對位置判斷最佳跑膠時(shí)間,以使目的蛋白處于分離膠面的下 1/3 的最佳分辯位置。


轉膜:

     

      ? 將 PVDF 膜放到甲醇中浸泡 2 min

      ? 將轉膜夾打開(kāi),在代表負極的黑色面鋪上一塊濕潤的海綿墊,再添加 2 層濕潤的濾紙,將 SDS-PAGE 膠小心地鋪在濾紙上,表面再覆蓋大小合適的 PVDF 膜;然后再覆蓋兩層濕潤濾紙,再墊上濕潤的海綿墊,將紅色的正極板合上,夾好,插入轉膜槽相應的位置。

      ? 轉膜過(guò)程在 4℃ 進(jìn)行,采用 100V/100mA。

      ? 麗春紅染色:轉膜過(guò)程完成后,將膜從轉膜夾中取出,立即投入麗春紅染液中染色,大約染色 5 分鐘后將膜由麗春紅中取出,用清水輕輕沖洗膜,注意觀(guān)察膜上的紅色條帶,當條帶足夠清晰后停止水洗,根據染色條帶把膜適當剪小,留出目的蛋白所在的范圍。然后用清水徹底沖洗膜,盡可能洗去殘留的麗春紅,使得條帶消失。

 

封閉:

     

      一般抗體采用 5% 脫脂奶粉+TBST 封閉;封閉時(shí)間為室溫下一個(gè)小時(shí),在搖床上進(jìn)行。

 

一抗雜交:

 

      在一個(gè) 1.5 ml 的 EP 管中加入 1 ml 的封閉液(5% 脫脂奶粉+TBST),再加入適量的一抗,置于 4℃ 冰箱中過(guò)夜。


洗膜:

 

      將過(guò)夜雜交的膜從塑料袋中取出,投入含有足量體積 TBST 的洗膜盒中,于搖床上清洗,每次 10 分鐘,連續 3 次。


二抗雜交:


      處理步驟類(lèi)似一抗雜交步驟,不同之處在于二抗雜交可在常溫下,1 小時(shí)內完成。二抗比例控制在 1:2000~1:5000。


顯影:


      將膜平放于干燥的平面上,將新鮮配置好的 ECL Reagent 滴加到有鉛筆記號標注的膜面上,反應 5 分鐘后用濾紙在膜的邊緣盡量吸去多余的 ECL Reagent,將膜放到化學(xué)發(fā)光儀中收集信號。

 

(本文轉載丁香園)

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