(一)無(wú)菌操作前的準備工作

     培養材料接種時(shí)的無(wú)菌操作過(guò)程除上述各項消毒滅菌操作外，還需完成以下無(wú)菌操作步驟，從而獲得接種的無(wú)菌培養材料。

     工作人員無(wú)菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對手臂消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進(jìn)入無(wú)菌操作區。如進(jìn)入層流操作室進(jìn)行實(shí)驗操作，應完成緩沖準備區內的淋浴、一次更換滅菌衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護衣帽、手套、拖鞋等；再在風(fēng)淋區進(jìn)行無(wú)菌風(fēng)淋后方可進(jìn)入層流操作室。進(jìn)入無(wú)菌操作區后，再用70%～75%的酒精擦拭雙手和前臂，完成無(wú)菌操作準備工作。

     用70%～75%酒精擦洗工作臺面后，將已消毒滅菌的實(shí)驗用品取出，并將操作器械放置在無(wú)菌器械支架上，然后開(kāi)始實(shí)驗操作。在實(shí)驗操作過(guò)程中，對所有操作器械每次使用后都要進(jìn)行滅菌，常采用酒精燈火焰灼燒滅菌。

     (二)無(wú)菌操作步驟

     準備工作完成后，對來(lái)自于自然生長(cháng)條件下的外植體，按上述培養材料消毒方法滅菌后取出，放入已滅菌的培養皿中，然后置超凈工作臺酒精燈火焰下方，用滅菌剪刀等器械進(jìn)行適當分離、切割或其它處理后備用。

     在酒精燈火焰處將培養容器的瓶塞(蓋)輕輕打開(kāi)，瓶口在燈焰處旋轉灼燒，用鑷子將培養材料置入培養液上，將鑷子在酒精瓶中浸蘸酒精，置酒精燈上灼燒后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞(蓋)數秒后塞回瓶口。對繼代培養材料的無(wú)菌操作，需在燈焰處打開(kāi)瓶塞(蓋)，繼代材料為液體培養細胞時(shí)直接用滅菌吸管吸取培養細胞液放入新培養液中；繼代材料為固體培養細胞時(shí)用滅菌鑷子挑取適量材料置新培養液上；繼代材料為其他組織時(shí)，用滅菌剪刀或其他器械進(jìn)行培養材料適當切割后，用滅菌鑷子將其置于新培養液上(中)，然后迅速灼燎瓶塞(蓋)數秒后塞回瓶口。

     (三)污染源及其表現特征

     當培養材料、轉接器皿、無(wú)菌操作環(huán)境等消毒滅菌不徹底時(shí)，培養材料則攜帶有微生物(microorganism)，當其被轉接到營(yíng)養豐富的培養液上時(shí)，微生物繁殖迅速，出現各種污染菌斑。

     微生物生長(cháng)時(shí)分泌出對植物組織有毒的代謝廢物，致使培養材料死亡或失去使用價(jià)值。在培養過(guò)程中，培養材料附近出現黏液或混濁的水跡，并有發(fā)酵狀泡沫，這是細菌性污染。在細菌性污染中，特別要注意一種呈乳白色的芽孢桿菌污染，它可出現在培養液表面，或呈滴形云霧狀存在于培養液內，若出現應嚴格滅菌。而培養液表面出現的黃色、白色、黑色等不同顏色的霉菌，這是真菌性污染。