一. 液體培養法
1. 將指定之寄主細菌以液體培養法于適當溫度下培養,一般培養16~24小時(shí)
2. 將噬菌體原液100 μl 與寄主細菌懸浮液300 μl均勻混合,靜置15分鐘使其感染。
3. 將混合液接至含10 ml新鮮液體培養基的試管中,于適當溫度下振蕩培養約8~24小時(shí),培養時(shí)間依噬菌體之不同而異。
4. 將培養液移入離心管中,以10,000 rpm (5,000 g)離心10分鐘,以沉淀寄主細菌。
5. 將上清液移至新管中,以0.22μm孔徑之過(guò)濾器(filter)去除殘余菌體,即得不含寄主細菌之噬菌體原液。但因噬菌體原液呈透明狀,無(wú)法以肉眼直接判斷其增殖效果,故應測定其效價(jià)以確認增殖培養之成效。
二. 雙層瓊脂培養法
1. 將指定之寄主細菌以液體培養法于適當溫度下培養,一般培養16~24小時(shí)。
2. 將噬菌體原液100 μl 與寄主細菌懸浮液300 μl均勻混合,靜置15分鐘使其感染。
3. 將混合液加入5 ml 冷卻至45℃的0.7﹪瓊脂培養基中,均勻混合后立即平鋪在已倒好的1.8﹪瓊脂培養基平板上。
4. 待平板凝固后移至適當溫度之培養箱中,一般培養8~24小時(shí),培養時(shí)間依噬菌體之不同而異。
5. 以上述相同之步驟制作另一不含噬菌體之對照組。
6. 將培養好的平板與對照組比較其澄清度,一般含噬菌體之平板呈澄清狀,而僅含寄主細菌之對照組則呈混濁狀。
7. 將含有噬菌體之平板置于 -20℃下4~5小時(shí)后,取出置于室溫下解凍。
8. 將解凍后產(chǎn)生的液體移入離心管中,以10,000 rpm (5,000 g)離心10分鐘以沉淀寄主細菌。
9. 將上清液移至新管中,以0.22 μm孔徑之過(guò)濾器(filter)去除殘余菌體,即得不含寄主細菌之噬菌體原液。
三. 表面瓊脂培養法
1. 將指定之寄主細菌以液體培養法于適當溫度下培養,一般培養16~24小時(shí)。
2. 將寄主細菌懸浮液3 ml均勻平鋪于1.8﹪瓊脂培養基平板上,靜置2小時(shí)。
3. 將余的寄主細菌懸浮液吸出,再將噬菌體原液0.3 ml均勻涂抹于平板上。
4. 于適當溫度下培養約16~24小時(shí),培養時(shí)間依噬菌體之不同而異。
5. 取5 ml 新鮮液體培養基加入平板中,以 L 形玻棒刮洗下平板表面之菌體。
6. 將刮洗下之液體移入離心管中,以10,000 rpm (5,000 g)離心10分鐘以沉淀寄主細菌。
7. 將上清液移至新管中,以0.22 μm孔徑之過(guò)濾器(filter)去除殘余菌體,即得不含寄主細菌之噬菌體原液。